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目的1、研究慢性HBV感染患者不同时期NK细胞功能的变化，以及与ALT水平、病毒载量的关系。2、横向分析慢性HBV相关慢加急性肝衰竭患者，不同血清总胆红素水平下NK细胞功能状态的差异，以及与ALT水平、病毒载量的关系。3、比较患者在治疗过程中，NK细胞频率及功能变化。方法1、63例慢性HBV感染者分为（1）HBV-相关的慢加急性肝衰竭患者18例，应用核苷类似物抗病毒综合治疗，在治疗过程中，87次抽取外周血，根据血清总胆红素分为3组即Tbil≥10ULN（正常上限值）（例次=59）、5ULN＜Tbil＜10ULN（例次=17）、Tbil＜5ULN（例次=11），（2）慢性HBV感染后处于免疫活化期患者30例，未行抗病毒治疗，（3）感染后处于免疫耐受期患者15例。健康对照32例，排除其他病毒及急性HBV感染，无其他肝炎病史。取外周肝素钠抗凝血5ml备检。2、时间分辨荧光免疫定量技术（TRFIA）定量检测乙肝病毒标志物五项指标即乙肝表面抗原及抗体(HBsAg和HBsAb)；e抗原及e抗体(HBeAg和HBeAb)；核心抗体(HBcAb)。应用Realtime-PCR定量检测HBV-DNA水平。雅培全自动生化仪检测肝功能九项指标。3、采用EZ-Sep人淋巴细胞分离管分离出外周血淋巴细胞（PBMC）。4、流式细胞术检测NK细胞频率、亚型、NK细胞表面受体（活化性受体/抑制性受体）表达水平，5、细胞内因子染色后检测NK细胞分泌γ-干扰素、肿瘤坏死因子-α等细胞因子的水平。6、细胞内因子染色后检测NK细胞分泌颗粒酶B、穿孔素，分析NK细胞细胞毒活性。7、FlowjoSoftware对流式图进行处理，SPSS20.0对数据进行统计分析，p值<0.05认为有显著差异性。结果1、慢性HBV感染不同时期NK细胞频率及功能分析（1）与健康对照组相比，慢性HBV感染不同时期PBMC中NK细胞频率均显著降低(P<0.05)，NK细胞亚型CD56dim频率均低于健康对照组(P<0.001)，而NK细胞亚型CD56bright频率均高于健康对照组(P<0.001)。各组之间比较，慢加急性肝衰竭患者NK细胞频率低于IA组、IT组(P<0.05)。（2）与健康对照组相比，IA组NK细胞活化性受体NKp46显著升高(P<0.05)，IT组表达NKp46、NKp30均也升高(P<0.05)，而IA组抑制性受体NKG2A表达下降(P<0.05)，IT组则无明显差异；ACLF组表达活化性受体和抑制性受体水平较健康对照均无明显差异；各组间比较也无明显差异。（3）与健康对照相比，慢性HBV感染患者NK细胞分泌细胞因子IFN-γ均较低(P<0.001)，细胞因子TNF-α与健康对照相比无明显差别；各组间比较IFN-γ分泌量均无明显差异，IA、IT组分泌TNF-α水平较ACLF组高，差异具有统计学意义(P<0.05)。（4）与健康对照相比，慢性HBV感染患者NK细胞分泌颗粒酶B水平均较低，其中IA组和ACLF组与健康对照相比差异具有统计学意义(P<0.05)，穿孔素分泌水平均高于健康对照组(P<0.01)。各组间相比显示，IA组、IT组分泌颗粒酶B水平明显高于ACLF组，差异具有统计学意义(P<0.05)，而穿孔素各组之间比较并无明显差异。2、HBV-相关ACLF患者Tbil不同水平下NK细胞频率及其功能变化（1）与健康对照相比，慢加急性肝衰竭患者NK细胞频率及CD56dimNK细胞频率均降低(P<0.05)，而CD56brightNK细胞亚群频率均较健康对照高(P<0.05)，但不同Tbil水平之间NK细胞频率和NK细胞亚群频率差异均无统计学意义。（2）与健康对照相比，ACLF患者NK细胞活化性受体NKp30表达水平升高(P<0.05)，NKp46表达水平较高，但无统计学意义，活化性受体NKG2D和抑制性受体NKG2A与健康对照均无明显差异。不同Tbil水平下各组间比较活化性受体与抑制性受体均无明显差异。（3）与健康对照相比，ACLF患者NK细胞分泌IFN-γ均显著较低(P<0.001)，TNF-α分泌量无明显差别；不同Tbil水平比较IFN-γ、TNF-α均无明显差别。（4）与健康对照相比，ACLF患者NK细胞分泌颗粒酶B水平均较低(P<0.01)，NK细胞分泌穿孔素水平较高(P<0.05)；不同Tbil水平比较显示第2组分泌颗粒酶B明显高于第3组(P<0.05)，而穿孔素不同Tbil水平之间无统计学差异。3、慢性HBV患者NK细胞功能与ALT水平及病毒载量的相关分析慢性HBV感染者ALT水平与NK细胞分泌细胞因子IFN-γ、TNF-α呈负相关，而NK细胞功能与病毒载量之间无明显相关性。ACLF患者NK细胞频率、分泌细胞因子IFN-γ、TNF-α与ALT水平均无明显相关性；HBV相关的慢加急性肝衰竭患者NK细胞频率与病毒载量无明显相关性，NK细胞分泌细胞因子IFN-γ、TNF-α水平与病毒载量呈负相关。4、HBV相关ACLF患者治疗过程中NK细胞频率及功能变化在Tbil下降过程中NK细胞频率及分泌细胞因子IFN-γ呈上升趋势，但差异无统计学意义；分泌细胞因子TNF-α未见明显趋势。NK细胞细胞毒活性中分泌穿孔素呈下降趋势，无统计学差异；而颗粒酶B表现不明显。结论1、慢性HBV感染不同时期NK细胞功能活性与健康对照相比均受到不同程度抑制，而ACLF患者受到抑制程度较CHB患者高。2、慢性HBV感染者NK细胞分泌细胞因子IFN-γ、TNF-α均与ALT水平呈负相关，NK细胞功能与病毒载量之间相关性不明显。HBV相关ACLF患者NK细胞分泌细胞因子IFN-γ、TNF-α均与HBV-DNA水平呈负相关，与ALT水平无明显相关性。3、动态观察ACLF患者，发现随病情恢复NK细胞频率及分泌因子IFN-γ有升高趋势，而细胞毒活性呈现下降趋势。本课题的创新点1、比较系统地研究了乙型肝炎病毒感染免疫耐受期、免疫活化期及免疫加重期NK细胞功能差异。2、从横向及纵向动态监测ACLF患者治疗过程中NK细胞功能的变化，以及与治疗的关系。本课题研究的意义通过分析慢性乙型肝炎患者不同时期及动态观察ACLF患者治疗过程中NK细胞功能活性状态，从宿主的天然免疫方面研究免疫反应在ACLF中发挥的作用，对进一步认识乙型肝炎的发病机制具有重要意义。