两栖动物的繁殖及幼体发育阶段均在水环境中进行,其皮肤具有较好的渗透性,所以对水环境中的污染物比较敏感。据国际自然保护联盟（IUCN）统计,近年来,两栖动物种群数量在全球范围内急剧下降,已经成为全球最为濒危的动物种类。研究表明,除气候变化及生存条件恶化之外,包括杀虫剂在内的环境化学污染物是影响两栖动物种群数量下降的主要因素之一。有机磷杀虫剂（organophosphate insecticides,OPs）作为农业生产中应用最为广泛的一类农药,其使用量占杀虫剂使用总量的30%。在为农业生产带来显著效益的同时,OPs也对环境、生态系统、非靶标生物以及人类健康造成了严重的影响,它的持续应用可导致土壤、地表水乃至地下水源污染,进而影响到整个水生生态系统,严重威胁到鱼和两栖类的生存。作为一类神经毒性剂,OPs对靶标生物的毒性机制主要是通过抑制的肌肉神经接头中的乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase,AChE,E.C.3.1.1.7）活性,即与活性位点丝氨酸残基形成共价键成为不易水解的磷酰化胆碱酯酶,使之失去水解乙酰胆碱（acetylcholine,ACh）的能力,抑制AChE的活性,进而导致ACh在突触内蓄积,诱发毒覃样和烟碱样效应,使中枢神经系统呈现中毒症状。由于不同种类的有机磷杀虫剂对乙酰胆碱酯酶的抑制能力不同,故其毒性也有所差异。敌百虫（trichlorfon）是我国目前农业生产及水产养殖中广泛应用的一种有机磷杀虫剂,在农林生产中的使用浓度范围为0.25～25.0 g/L,在水产养殖业中的使用浓度通常为0.1～1.0 mg/L。敌百虫的长期应用,不仅会造成相应的农产品污染,也可能通过食物链在多种生物体内蓄积,对处于食物链顶端的高等动物及人类产生毒性作用。此外,敌百虫也可通过施药、挥发、地下水渗漏等方式污染地表水及地下水,对水源地水域生态环境、饮用水安全及非靶标生物的生存构成严重威胁。为评价以敌百虫为代表的低毒类OPs对非靶标生物的毒性作用,本研究首先以不同发育时期的中国林蛙（Rana chensinensis）为研究对象,通过急性毒性试验,获得敌百虫对林蛙蝌蚪的毒性指标,进而对低剂量敌百虫暴露胁迫蝌蚪生长发育的影响进行探讨。同时,结合行为学模型对敌百虫暴露后林蛙蝌蚪的行为退变进行监测及分析,评价低剂量敌百虫暴露诱发蝌蚪个体及社会行为的改变。其次,为进一步明晰低剂量敌百虫暴露对机体中神经递质代谢的影响,我们对低剂量敌百虫暴露后中国林蛙肌肉、脑及脊髓组织中神经递质活性剂的含量进行检测,为探讨低剂量有机磷杀虫剂暴露诱发的多种毒性机制提供依据,也为筛选新的生物标志物建立基础。再次,本研究还应用RNA-seq技术构建了低剂量敌百虫暴露前、后中国林蛙脑组织差异表达基因的cDNA文库,全面解析低剂量敌百虫长期暴露诱导中国林蛙脑转录组改变的分子应答机制及其对机体中多种代谢通路的干扰作用。最后,利用Western blot技术对差异表达基因在脑及肌肉组织中的蛋白表达水平进行了定量检测,进而通过免疫组化技术对所获得的差异表达基因进行细胞定位分析。具体研究结果如下:1.敌百虫对中国林蛙蝌蚪的急性毒性效应。研究结果表明,暴露24、48、72和96 h,敌百虫对中国林蛙蝌蚪的半致死浓度（LC50）分别为 142.50±3.23、49.19±1.28、25.68±2.04、15.55 ± 1.93 mg/L,安全浓度（SC）为1.56±0.19mg/L。在相同暴露时间,蝌蚪的死亡率随着敌百虫浓度的增加及处理时间的延长而升高。随着暴露时间的延长,蝌蚪对外来刺激的反应愈发迟缓,似丧失知觉。蝌蚪中毒后表现为尾部多呈弯曲状、仰翻及外观浮肿。2.低剂量敌百虫持续暴露对中国林蛙蝌蚪生长发育的毒性效应。研究结果表明,低剂量敌百虫持续暴露对蝌蚪生长具有抑制作用。暴露21 d,与对照组相比,各敌百虫处理组蝌蚪的体长、体重增加随暴露浓度的增加呈下降趋势;暴露42 d,与对照组相比,各敌百虫处理组蝌蚪体长、体重增加均受到显著抑制,其中,1.0、2.0 mg/L处理组抑制效应极显著（p＜0.01）。敌百虫对蝌蚪生长的抑制效应在一定浓度范围呈剂量效应,随着暴露时间的延长,抑制效应逐渐显著,呈现时间累积效应规律。同时,低剂量敌百虫持续暴露对蝌蚪发育也具有抑制作用。研究结果表明,各敌百虫处理组75%个体完全变态时间均滞后于对照组;蝌蚪的死亡率和畸形率均高于对照组,且蝌蚪的死亡率随敌百虫剂量的增加而升高,呈现明显的剂量和时间累积效应。此外,低剂量敌百虫持续暴露可导致蝌蚪身体扭曲、尾部强直性弯曲等畸型发生。因此,低剂量敌百虫持续暴露对中国林蛙蝌蚪的生长发育具有抑制和毒性作用,SC以下的敌百虫水体中长时间暴露仍威胁着蝌蚪的生存。3.低剂量敌百虫暴露对中国林蛙蝌蚪个体行为的毒性效应。通过低剂量敌百虫暴露对蝌蚪个体运动行为的影响效应的研究结果表明,低剂量敌百虫暴露对蝌蚪个体运动行为具有抑制作用,且抑制作用的显著性与暴露浓度和时间呈累积效应。进而,通过对运动行为的量化分析结果表明,在敌百虫暴露两周后,middur及burdur运动显著增加,此后随着暴露时间的持续,其差异又逐渐消失。因此,敌百虫对蝌蚪运动行为具有扰乱作用,可引起蝌蚪活动能力的降低。敌百虫暴露诱发的蝌蚪活动能力的降低可直接导致两栖类幼体群落在栖息地的空间格局的减小,使其种群密度增大,这样将极易遭受天敌侵袭,从而降低幼体的存活率。同时,蝌蚪活动能力的降低也可直接导致其在遭受捕食过程中警戒行为延迟,降低逃逸几率,增加了被捕食的风险。4.低剂量敌百虫暴露对蝌蚪社会行为的毒性效应。研究结果表明,低剂量敌百虫暴露后,导致蝌蚪之间接触频率降低,接触时间延长,这种社会行为的变化与敌百虫暴露浓度密切相关。在相同暴露时间,蝌蚪接触频率社会行为随敌百虫暴露浓度的升高而下降;随暴露时间的延长,接触频率的下降幅度增加,表现为蝌蚪社会反应行为的降低。与之相反,蝌蚪之间接触时间与敌百虫暴露浓度呈正相关,在相同暴露时间,蝌蚪间接触时间随敌百虫暴露浓度的增加而延长,诱发行为延迟效应。因此,低剂量敌百虫暴露对蝌蚪间社会行为具有扰乱作用,降低了蝌蚪的社会反应行为,诱发了行为延迟效应。5.低剂量敌百虫暴露对机体内神经递质代谢的毒性效应。为明晰低剂量敌百虫暴露对机体内神经递质代谢的的影响,将中国林蛙暴露于低剂量敌百虫后,分别检测其肌肉、脑及脊髓组织中AChE、乙酰胆碱转移酶（choline acetyltransferase,ChAT）、羧酸酯酶（carboxylesterase,CarE）及 ACh等与OPs毒性作用机制密切相关的酶活性及神经递质含量变化。结果表明,低剂量敌百虫暴露会引起AChE、CarE活性及ACh含量降低,而ChAT活性的变化与受检组织相关。因此,低剂量敌百虫暴露在导致动物神经毒性的效应中,对胆碱能递质的代谢过程显示出显著的干扰作用。此外,除AChE外,CarE和ChAT也可作为监测OPs环境污染的生物标志物。6.低剂量敌百虫暴露对中国林蛙脑转录组学及基因表达谱分析。为阐明低剂量敌百虫水域污染对非靶标水生生物神经毒性转录模式的分子机制,用RNA-seq技术构建低剂量敌百虫暴露前、后中国林蛙脑组织差异表达基因的cDNA文库,共获得102,013个独立基因,平均长度为942 bp,N50为1,756 bp。功能注释结果表明,共有45,600个独立基因（44.7%）可在Nr、Nt、Swiss-Prot、KEEG、COG及GO数据库中完成功能注释。基于BLAST对获得的独立基因在Nr数据库的相似性分析结果表明,70.41%独立基因与两栖类基因具有较高相似性。GO功能注释可将23,449个独立基因注释到生物过程（biological process）、细胞组分（cellular component）及分子功能（molecular function）三大类。COG 功能注释可将12,187个独立基因分为25个类群。KEGG功能注释结果表明,27,396个独立基因共参与了 259个KEGG通路。这一 cDNA文库为深入研究低剂量敌百虫干扰神经系统功能的分子机制提供了重要数据。7.神经代谢通路相关差异基因的鉴定及分析。通过对低剂量敌百虫暴露前、后中国林蛙脑组织差异表达基因筛选,共获得874个差异表达基因。其中,397个基因表达上调,477个基因表达下调。对所获得的差异表达基因进行了 GO及KEGG功能注释。分析结果表明,低剂量敌百虫暴露了影响了中国林蛙神经系统代谢通路及应答机制,对其正常生物学功能形成干扰。对差异表达基因中与神经代谢通路相关的4个差异基因进行了 qPCR验证结果表明,差异基因的表达趋势与RNA-seq检测结果完全一致。其中,G蛋白γ2亚基基因（GNG2,CL9287.Contig1）和 JAK 激酶 2 基因（JAK2,CL2923.Contig1）表达量显著上调;而GABAA受体基因（GABAA receptor,Unigene23938）和γ-神经突核蛋白基因（SNCG,Unigene4098）表达显著下降。说明RNA-seq技术构建的脑组织cDNA文库是有效的。其中,GNG2基因与G蛋白偶联受体（GPCR）信号通路有关,对内向整流钾离子通路（G protein gated inward rectifier K+channel,GIRK）具有调节作用。GNG2基因表达量上调,可激活GIRK通路,使细胞内钾离子外流,引起细胞膜超极化状态,进而对胆碱能系统形成抑制作用。JAK2基因不仅参与细胞的增殖、分化,还在DNA损伤和修复过程中发挥重要作用。JAK2基因表达量的上调,说明低剂量敌百虫暴露引起了中国林蛙氧化应激反应,对机体免疫应答形成抑制。作为中枢神经系统里的一种主要的递质,GABAA受体基因表达量的下降表明,低剂量敌百虫暴露也可作用于GABAA受体-Cl离子通路,干扰中国林蛙正常生理过程。SNCG基因在神经退行疾病中具有重要作用,其表达量的下调是机体为应对低剂量敌百虫胁迫产生的应答,以保持突触正常功能。综上,通过信号通路分析表明,敌百虫除对乙酰胆碱递质的功能抑制作用机制外,还可作用于机体的其他受体或离子通路,从而将干扰多种递质通路的正常功能。8.差异基因JAK2及GABRD的蛋白及细胞表达分析。采用Western blot对JAK2及GABRD在中国林蛙脑和肌肉组织的蛋白表达检测结果表明,敌百虫暴露后,JAK2及GABRD蛋白在林蛙脑和肌肉组织中的表达量显著下降。免疫组化检测JAK2及GABRD在中国林蛙脑组织中的表达结果表明,JAK2的表达量随暴露时间的持续而显著降低,GABRD在脑组织的阳性细胞表达量也降低,此后随处理时间的延长又与对照组一致。因此推测,低剂量敌百虫不仅干扰机体的胆碱能系统,也可通过作用于GABA受体,扰乱GABA能系统的活动。综上,低剂量敌百虫长时间暴露仍威胁着蝌蚪的生存,对其生长发育具有抑制和毒性作用,且随着暴露时间的延长对敌百虫刺激后的运动愈发迟缓,其效应可表现为对个体行为具有抑制作用。低剂量敌百虫暴露对蝌蚪个体运动的抑制作用与暴露浓度和时间相关,在短时间内可引起middur及burdur运动的显著增加。个体活动能力的降低减小了两栖类幼体群落在栖息地的空间格局,增加了其被捕食的风险。与此同时,低剂量敌百虫暴露对蝌蚪间社会行为具有扰乱作用,降低了蝌蚪的社会反应行为,诱发了行为延迟效应。运动机能的减退主要与低剂量敌百虫对胆碱能递质的代谢过程的干扰作用引起了神经递质的代谢紊乱,从而诱发神经毒性效应。进一步通过信号通路分析表明,低剂量敌百虫暴露可引起中国林蛙氧化应激反应,对机体免疫应答形成抑制,同时,还可扰乱机体GIRK通路及Cl离子通路,干扰正常生理过程,进而对神经系统胆碱能形成抑制作用。该实验结果证明了除对乙酰胆碱酯酶的抑制作用机制外,敌百虫还可作用于机体的其他受体或离子通路,从而干扰多种递质通路的正常功能。这些结果可为进一步深入研究低剂量有机磷农药对于非靶标动物的毒理机制提供基础,也为两栖动物生殖环境的保护、水生生态风险评价以及水域污染的治理提供依据。实验结果也提示,与神经递质Ach代谢相关的CarE和ChAT可作为监测OPs的生物标志物。