研究背景:骨关节炎（osteoarthritis,OA）是一种与衰老相关的、主要病理表现为关节软骨破坏的退行性疾病。OA治疗方法非常有限,常用的治疗措施主要是缓解症状,目前尚没有可以干预OA进展的药物。因此明确OA的发病机制,进而针对性的早期干预尤为重要。不同类型的OA发病机制不同。继发性OA的主要原因有:创伤、肿瘤等因素。原发性OA机制尚不明确,一些研究认为年龄、性别、肥胖等因素可能参与了其发病,为早期干预带来困难。流行病学研究表明OA主要影响中老年人群,发病率表明女性在绝经前与男性相似,但是,随着女性进入绝经期,绝经后女性OA发病率明显高于男性。传统观点将绝经后女性OA发病升高的原因归结于雌激素（E2）水平的下降。然而,临床上的一些现象并不能仅仅用E2水平的降低解释,提示其他因素可能参与了OA的发生发展。研究发现:围绝经期女性卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone,FSH）水平升高早于E2水平的下降;在E2水平还处于相对正常的水平,仅有FSH升高时,OA的患病率已经开始显著升高。且课题组的前期研究发现FSH与绝经后女性膝OA的严重程度相关,是OA的独立危险因素。然而,FSH对关节软骨或OA影响的研究甚少,亟待明确。本研究从这一现象出发,探讨FSH对软骨细胞的影响,寻找绝经后OA的发病原因。FSH是由垂体合成的糖蛋白激素,其受体FSHR（FSH receptor,FSHR）是一个七次跨膜的G蛋白偶联受体（GPCR）。一般来说,当配体与细胞膜上的受体结合后,可以通过不同的Gα蛋白（Gαs、Gαi、Gαq、Gα12）激活下游第二信使,作用于不同的反应元件发挥功能。以往认为FSH主要在性腺轴上发挥作用,通过结合在卵巢上的FSHR,调控卵泡的发育和雌激素分泌。根据课题组前期发表的研究,FSHR在人和小鼠原代软骨细胞上有表达。我们推测FSH通过与FSHR结合,影响特定的Gα蛋白,活化下游信号通路,对软骨细胞产生影响。越来越多研究认为OA不仅仅累及关节软骨,而是与整个关节有关的疾病。但是软骨的病理改变贯穿OA的整个环节。软骨中只有一种细胞——软骨细胞,它参与了细胞外基质（extracellular matrix,ECM）的合成。ECM主要成分是胶原,占软骨干重的60%。其中Ⅱ型胶原（type Ⅱ collagen,Coll-Ⅱ）占所有胶原的90-95%,是关节软骨主要的胶原成分。研究表明OA时软骨细胞出现分化异常。软骨细胞分化异常是OA的核心环节,探索软骨细胞行为改变对了解OA发病机制十分必要。软骨细胞在一些病理刺激下可以经历去分化。因软骨细胞去分化在OA发生发展中发挥了重要作用,逐渐引起了大家的关注。去分化的软骨细胞也被认为是幼稚的软骨细胞。研究发现去分化的软骨细胞表现出间充质干细胞的特点,如细胞形态由类圆形向长梭形改变;且软骨细胞分化标志物Coll-Ⅱ表达减低。因此,软骨细胞去分化可以导致软骨细胞表型的消失、ECM重塑,最终导致软骨机械性能下降和OA的发生。故本研究通过检测FSH对软骨细胞分化相关指标、分化主要标志物Coll-Ⅱ、细胞骨架影响,探究FSH对软骨细胞去分化的影响。研究表明ERK1/2 MAPK和p38 MAPK信号通路参与软骨细胞去分化。抑制p38 MAPK信号通路可以防止软骨细胞向肥大细胞分化;而抑制ERK1/2信号通路则可以增加Coll-Ⅱ的表达,促进软骨细胞分化。由此,ERK1/2和p38信号通路对软骨细胞分化的作用是相反的。本研究观察FSH对ERK1/2和p38信号通路的影响,并利用信号通路抑制剂,明确这两个通路在FSH影响的去分化中的作用。FSH抗体（FSH antibody,FSHAb）阻断小鼠模型是研究FSH效应缺失的经典模型。研究表明阻断FSH可以改善小鼠的骨质疏松、改善肥胖和高胆固醇血症的发生。在本研究中,我们利用FSH抗体阻断FSH,观察阻断FSH是否可以预防小鼠的膝关节软骨退变和软骨细胞去分化。研究表明表面区蛋白（superficial zone protein,SZP）或者蛋白多糖 4（proteoglycan 4,Prg4）在 OA 早期即可发现表达减低,是OA的早期标志物。早期生长反应蛋白1（early growth response protein 1,Egr1）在OA软骨中明显升高,且调控OA进展,被认为是OA的标志物。我们检测了这两个指标,寻找FSH调控绝经后OA的证据。本研究以绝经后女性OA发病率增高为切入点,通过体内和体外研究探究FSH对软骨细胞的影响和机制。体外研究利用原代软骨细胞和ATDC5软骨细胞系,发现FSH可以促进软骨细胞去分化;体内利用FSH抗体阻断小鼠模型,发现阻断FSH可以预防软骨退变、抑制软骨细胞去分化。对其机制进行探索,发现FSH通过结合FSHR,偶联Gαi蛋白,一方面活化ERK1/2,抑制p38信号通路,一方面抑制SOX9-CREB信号通路,最终导致Coll-Ⅱ表达减低,ECM合成减少。我们的研究揭示了 FSH对软骨细胞去分化的影响,建立了 FSH调控去分化的信号通路,为FSH影响绝经后OA提供支持依据和治疗靶点。研究目的:1.利用原代软骨细胞及软骨的细胞系——ATDC5细胞,明确FSH可以引起软骨细胞去分化。2.利用ERK1/2和p38通路抑制剂,G αi蛋白抑制剂和Fshr小干扰RNA阐明FSH调控软骨细胞去分化的信号通路。3.通过检测关节软骨FSHR的表达,对FSHR进行组织定位。通过检测FSHAb小鼠膝关节软骨的去分化指标（Coll-Ⅱ）、软骨细胞数目、软骨厚度、OA评分和OA标志物的表达,探讨阻断FSH在预防关节软骨退变中的作用。研究方法:1.细胞培养:小鼠原代软骨细胞和ATDC5软骨细胞系按照培养条件培养。细胞处理之前无血清培养基饥饿两小时去除血清中激素的影响。2.小鼠模型:9周龄雌性C57BL/6J小鼠分为两组,一组注射FSH中性抗体（FSHAb）组,一组注射IgG抗体（IgG对照组）,分别腹腔注射FSH和IgG抗体,持续8周。3.CCK8实验:设置时间梯度（24h、48h、72h）和浓度梯度（0ng/mL、10ng/mL、100ng/mL）观察FSH对原代软骨细胞活力的影响。4.实时荧光PCR（qRT-PCR）实验:FSH（10ng/ml）刺激原代软骨细胞后,提取RNA进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）实验,检测Co12al,Acan,Sox9,Sox5,Mmp3,Mmp13,Col10a1,Ihh,Pth1h等分化相关的基因的表达。观察对细胞分化的影响。检测FSH对原代软骨细胞Prg4和Egr1的影响,确定FSH对OA标志物（Prg4,Egr1）的影响。5.蛋白免疫印迹（Western blot）实验检测FSH对细胞分化标志物等指标的影响。6.细胞免疫荧光实验:检测ATDC5细胞表面FSHR的表达。细胞免疫荧光检测FSH（30ng/ml）对 ATDC5 细胞 Egr1 和 Prg4 的影响。7.鬼笔环肽染色:FSH（0ng/mL、3ng/mL、10ng/mL、30ng/mL）刺激 ATDC5 细胞后行鬼笔环肽染色对软骨细胞骨架蛋白（F-actin）进行检测,确定FSH对细胞形态的影响。8.Fshr siRNA干扰实验:设计3对siRNA（#1,#2,#3）,转染siRNA后,利用qRT-PCR检测fshr的表达,选择效率最高的一条（#2）用于后续试验。原代软骨细胞转染#2 fshr siRNA后。提取蛋白进行Western blot实验,观察对主要分化标志物Coll-Ⅱ的影响。明确FSHR在FSH介导的软骨细胞去分化中的作用。9.cAMP检测实验:FSH刺激原代软骨细胞后,检测cAMP的表达。百日咳毒素（PTX）可以干扰Gαi的表达,用来确定Gαi的作用;毛喉素（forskolin）可以刺激cAMP,用来作为阳性对照。选用Cayman的cAMP试剂盒进行检测。10.免疫组化:小鼠膝关节软骨组织切片行免疫组化实验检测FSHR的表达,确定FSHR在关节软骨的定位;检测Coll-Ⅱ、Coll-Ⅹ的表达,确定阻断FSH对软骨细胞分化的影响。Ki67染色确定阻断FSH后对细胞增殖的影响。Egr1染色检测阻断FSH对Egr1的影响。11.番红/固绿染色:IgG和FSHAb小鼠取膝关节,进行石蜡包埋、切片后行番红染色指示软骨组织;固绿染色指示骨组织,观察软骨组织的损伤和软骨细胞情况。12.Mankin评分和OARSI评分:利用Mankin评分和OARSI评分对两组小鼠膝关节组织进行评价,分析关节软骨的损伤和退变情况。13.MicroCT:观察膝关节周围骨质的变化。14.统计学分析:用Graphpad对数据进行分析,两组比较采用非参数检验后的Mann-Whitney检验,多组比较采用非参数检验后的Kruskal-Wallis检验。P值小于0.05被认为有统计学意义。研究结果:1.FSH不影响软骨细胞凋亡和增殖利用CCK-8试剂盒,发现FSH（0ng/mL、10ng/mL、100ng/mL）在不同时间点（24h、48h和72h）不影响软骨细胞活力,提示FSH对细胞没有毒性。2.FSH促进软骨细胞去分化qRT-PCR结果显示FSH影响软骨细胞分化相关的指标。主要表现为FSH下调Col2a1,Acan,Sox9,Sox5,Mmp3,Mmp13,Col10a1;下调促进分化的Ihh基因,上调抑制软骨细胞分化的Pth1h基因,提示FSH抑制软骨细胞分化。Western blot结果显示FSH剂量依赖性的抑制Coll-Ⅱ、COMP、aggrecan的合成,抑制Coll-Ⅱ的转录因子SOX9的合成;抑制CREB的磷酸化水平,提示影响CREB/SOX9/Coll-Ⅱ信号通路。鬼笔环肽染色显示FSH引起ATDC5细胞骨架重塑,由类椭圆形向长梭形改变,提示去分化样改变。3.ATDC5软骨细胞系有FSHR的表达课题组前期发表的研究观察到原代软骨细胞上有FSHR的表达,但是软骨细胞系上是否有受体表达尚无研究。细胞免疫荧光显示FSHR在ATDC5细胞表面有表达,ATDC5细胞系可以用于后续的实验研究。4.FSH通过FSHR调控软骨细胞去分化利用siRNA干扰fshr,观察到干扰Fshr可以逆转FSH下调的Coll-Ⅱ,提示FSHR参与了 FSH调控的软骨细胞去分化。5.Gai蛋白参与FSH调控的软骨细胞去分化利用cAMP试剂盒检测FSH是否影响第二信使cAMP的表达,结果显示FSH可以抑制cAMP的合成。用PTX抑制Gαi蛋白后,可以逆转FSH下调的cAMP和Coll-Ⅱ,表明Gαi蛋白参与FSH调控的软骨细胞去分化。6.ERK1/2 MAPK和p38 MAPK信号通路介导了 FSH调控的软骨细胞去分化Western blot实验显示FSH可以上调ERK1/2 MAPK磷酸化水平,下调p38 MAPK的磷酸化水平。用ERK1/2的抑制剂PD98059可以逆转FSH下调的Coll-Ⅱ;用p38抑制剂SB203580可以促进FSH下调Coll-Ⅱ。结果提示ERK1/2和p38参与FSH调控的软骨细胞去分化。7.FSHR定位于小鼠膝关节软骨的表面区组织切片免疫荧光显示FSHR主要定位于关节软骨的表面区（superficial zone,SZ）,提示FSH可能主要影响表面区的软骨细胞。8.FSH抗体（FSHAb）阻断可以改善骨小梁微结构、防止软骨细胞去分化和关节软骨退变FSHAb阻断可以改善骨小梁相关参数,增加软骨Coll-Ⅱ的表达;改善OA的相关评分如Mankin Score和OARSI Score。番红染色提示阻断FSH后番红染色加深,软骨面损伤减少,软骨厚度增加,软骨细胞数目增加。免疫组化显示阻断FSH可以提高Ki67阳性的细胞数和强度。以上提示阻断FSH可以防止软骨细胞去分化和软骨退变。9.FSH影响OA标志物近期研究表明Prg4和Egr1是OA的标志物,我们观察到FSH可以上调Egr1,降低Prg4的表达。阻断FSH效应后可以降低Egr1的表达。以上提示FSH可能通过影响OA标志物参与OA的发生。结论:1.FSH抑制软骨ECM合成,参与调控软骨细胞去分化。2.FSH通过结合FSHR,偶联Gai蛋白,调控ERK1/2和p38信号通路以及Sox9-CREB-Coll-Ⅱ信号通路调控的软骨细胞去分化。3.FSH影响OA的两个标志物Egr1和Prg4的表达。4.阻断FSH可以改善骨微结构,增加软骨细胞数目、软骨厚度,防止软骨损伤和软骨细胞去分化。