肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是原发性肝癌中最常见的组织学类型，为我国常见的恶性肿瘤之一。据IARC(international agerlcy forresearch on cancer)估计，2000年全球肝癌发病人数为56.4万，死亡54.9万人；我国每年约有24万人死于肝癌，占全球肝癌死亡数的45﹪。肝癌的发病率与死亡率接近，并且肝癌恶性程度高、预后差。近几十年来全世界肝癌发病率、死亡率呈上升趋势，因此引起研究者的高度关注，积累了大量的研究资料。肝癌不易早期发现，确诊时己多属中晚期，因而远期生存率很低，因此，早期诊断及早期治疗是肝癌防治的关键，发展敏感而特异的肿瘤标志物对肝癌的早期诊断至关重要，直接关系到治疗方法的合理选择和患者的远期生存率。肿瘤标志物的筛选和鉴定对肿瘤的诊断具有重要意义。肿瘤标志物以无创性和简便的优点成为肿瘤早期诊断和病情监测的重要指标。表观遗传学兴起为从该角度推动肿瘤分子标志物发展提供了可能。DNA甲基化是表观遗传学三个组成部分之一，也是迄今为止研究最为成熟的一部分。DNA甲基化在肿瘤细胞中的具体表现为肿瘤细胞基因组整体的甲基化水平降低和特定基因5端区域异常的甲基化改变两端。特定位点CpG甲基化与否，或者几个这样的位点构成的甲基化模式的组合就成为肿瘤细胞的标志物。目前基因组CpG岛甲基化检测的方法主要有：(1)甲基化敏感的限制性内切酶法；(2)亚硫酸氢钠法(sodium bisulfite，NaHSO<,3>)：(3)化学测序法为基础的甲基化分析。 本课题的研究把亚硫酸氢钠修饰方法与反向点杂交方法结合一起应用到临床HCC的检测。基于NaHSO<,3>修饰后序列C/T的变化设计针对MAGE-A3 5端甲基化模式改变的特异性探针，进行反向点杂交(reverse dot blot，RDB)，从而判断5端CpG位点甲基化模式。黑色素瘤抗原家族(melanoma antigenfamily or MAGE family)DNA编码序列位于X染色体长臂末端(Xq28)，由至少12个基因成员组成，肿瘤抗原MAGE-A3(MAGE-A3)为其中一员。它们只在肿瘤中表达，而在其他组织(正常组织，除睾丸和胎盘外)均不表达。研究表明MAGE-A3基因的表达主要由其5端CpG岛甲基化/去甲基化机制调控。这就使得MAGE-A3基因5端甲基化模式改变的检测可能成为HCC早期诊断肿瘤标志物。 试验目的： 本研究拟根据细胞株Hep G2和正常对照外周血白细胞(WBC)DNA的甲基化模式差异，设计相应的特异性探针，应用DNA杂交仪建立一种反向点杂交方法；同时，收集广州地区肝细胞肝癌病理组织标本、肝硬化病理组织标本及正常对照健康志愿者的外周血标本进行验证，并结合患者的临床AFP检测结果，综合分析临床患者资料，提高HCC检测的阳性率，以期达到早期诊断的目的。 方法与结果： 在实验中，用亚硫酸氢盐修饰后PCR测序(BSP)方法，检测细胞株Hep G2和外周血白细胞(WBC)DNA正常对照的甲基化模式差异，寻找HCC特异的MAGE-A3甲基化模式。根据HCC特异甲基化模式设计探针进行RDB杂交，从而判断5端CpG位点甲基化模式。通过对肝癌细胞株的研究表明，MAGE-A3的5端CpGh位点甲基化模式表现与正常对照明显不同，由此设计的探针检测HCC病理组织标本、肝硬化组织标本和正常对照组，检测HCC肝组织灵敏性和特异性分别是83﹪(25/30)和100﹪(60/60)。以亚硫酸氢盐修饰为基础的RDB方法与临床HCC诊断金标准病理诊断检测的检测结果之间相互关联(P<0.05)，两种方法的检验结果具有很好的一致性Kappa=0.870，为临床应用NaHSO<,2>修饰后RDB方法提供了可行性证据。结合标本临床资料，经统计学软件SPSS11.0分析发现MAGE-A3基因5端CpG位点异常甲基化位点的检测结果与其患者血清AFP水平的检测结果指标相互独立(P>0.05)，两检测方法的检测结果无相关统计学意义。 结论： 1.本实验建立了一种以亚硫酸盐修饰为基础的反向点杂交方法，并用该方法检测HCC中MAGE-A3 5端CpG位点异常甲基化的反向点杂交方法。该方法能够同时检测多个甲基化位点，以提高甲基化检测的灵敏性。 2.MAGE-A3基因5端CpG位点异常甲基化作为HCC肿瘤标志物的可行性进行了初步探讨。 3.HCC中MAGE-A3基因5端CpG位点异常甲基化检测与临床患者血清AFP水平之间的关系进行初步探讨，统计数据显示两者之间无相关无相关统计学意义。