菌蜕技术(bacterial ghost technology)是指在革兰氏阴性细菌细胞内可调控地表达大肠杆菌噬菌体FX174的溶菌基因E，从而引起宿主菌细胞裂解(溶菌)的一项基因工程技术。溶菌基因E的表达产物在宿主细胞的细胞膜和细胞壁上形成一个40-200 nm直径的跨膜孔道，细胞质、核糖体、核酸等细胞内容物在渗透压作用下从这个跨膜孔道流出细胞，如此形成的缺少细胞浆和核酸的、死的(无繁殖力的)细菌空壳就被称为菌蜕(bacterial ghosts，BGs)。E基因介导制备的菌蜕实际上是在非变性条件下灭活的细菌细胞，因此是优良的候选灭活菌体疫苗，而且在作为递呈异源蛋白抗原、DNA疫苗甚至药物的载体方面也呈现出广阔的研究、开发前景。 本课题研究通过PCR扩增获得噬菌体FX174的溶菌基因E，应用DNA定点突变技术纠正了E基因序列中存在的琥珀突变，构建成功利用串联的pR、pL双启动子表达溶菌基因E的高效溶菌载体pElys1。pElys1在大肠杆菌工程菌株XL-1 blue中具有极高的溶菌效率，溶菌动力学检测表明整个溶菌过程只需90min即可完成，溶菌后的活菌数(cfu/ml)比溶菌前下降超过5个指数级，溶菌(灭活)效率高达99.9997％，比国外研究者构建的pR或pL单启动子溶菌载体在同株大肠杆菌中的溶菌灭活效率高一个指数级。 PCR扩增由cI857、pR—pL、E基因、终止子构成的完整的溶菌基因表达盒LC，经T—A克隆后亚克隆入氯霉素抗性的广宿主质粒pBBR1MCS，构建成功广宿主溶菌载体pBBR1ys。将该溶菌载体通过电击方式转化入禽致病性大肠杆菌(APEC)野毒株RC-123中，溶菌动力学试验证实该溶菌载体对RC-123的溶菌灭活效率达到了99.9916％，而且制备的RC-123菌蜕经过冻干制备的菌蜕疫苗检测不出活菌。动物免疫试验结果表明该菌蜕疫苗(未加任何佐剂)对10倍LD50剂量同源野毒株攻毒的雏鸭的免疫保护率达到75％，高于传统福尔马林灭活苗的68.75％。 通过两次T—A克隆和一次亚克隆，构建了两端为LacZ基因序列、中间为溶菌基因表达盒LC的等位基因片段LacZ：LC。等位基因片段LacZ：LC通过电击转化入APEC RC-123感受态细胞后，等位基因片段LacZ：LC以LC两端的LacZ基因序列作为同源臂，与RC-123基因组中的LacZ基因发生双交换同源重组。PCR鉴定证实LC已插入RC-123基因组的LacZ基因中，构建成功核基因组依赖的APEC菌蜕菌株RC-123(ALacZ：LC)。溶菌动力学检测结果表明RC-123(△LacZ：LC)的溶菌灭活效率达到了99.9913％，与广宿主溶菌载体pBBRlys在同株细菌中的溶菌灭活效率(99.9916％)基本相当。 以高效溶菌载体pElys1为基础，通过定点突变技术在E基因与其上游的RBS位点之间引入平末端酶切位点EcoR V，构建成功前T载体pElysM。用该前T载体pElysM按常规的酶切后加T的方法即可制备高效温控正筛选T载体pEz—T。pEz—T用于T—A克隆时，只需用特定的温度(42℃)培养转化子即可筛选出阳性克隆。pEz—T的自连、转化实验证实，由于对该T载体PCR片段插入位点的创新设计，其在用于T—A克隆时不会像传统蓝白斑筛选T载体一样因为T载体自连而产生假阳性克隆。在对长度分别为219、603和1430 bp的PCR片段进行的3个应用性T—A克隆实验中，菌落PCR鉴定和测序结果均证实这些PCR片段被高效、快捷地克隆入该T载体中，而且没有假阳性克隆产生。本课题研发的高效温控正筛选T载体pEz—T克服了现有蓝白斑筛选T载体在使用中成本高、操作繁琐和有假阳性克隆的技术缺陷，因此具有极大的应用、推广价值。