研究背景:泛素蛋白酶体系统(UPS)的组成包含泛素激活酶(Els)、泛素结合酶(E2s)、泛素连接酶(E3s)、蛋白酶体(Proteosome)和去泛素化酶(DUBs)。自20世纪70年代早期发现泛素以来,研究表明UPS实际上参与了细胞生物学的所有方面。蛋白泛素化为可逆的翻译后修饰,在此过程中,E1、E2和E3按顺序发挥作用,将泛素(Ub)通过本身末端的甘氨酸残基(G76)通过共价键连接到底物蛋白的赖氨酸残基(K)上。单个泛素分子连接称为单泛素化。多个赖氨酸残基同时连接单个泛素分子称为多单泛素化或多泛素化。泛素分子自身有7个赖氨酸残基(K6,K11,K27,K29,K33,K48,K63),可以通过迭代反应形成不同类型的泛素链,称为多聚泛素化。一般情况下,K48连接的多聚泛素化常意味着被修饰底物将由蛋白酶体降解,而单泛素化和K63连接的多聚泛素化作为建立蛋白质-蛋白质相互作用和调节细胞功能的信号装置。DUBs执行泛素连接的水解过程。在人类中迄今发现了八种E1s、十几种不同类型的E2s、几百种E3s和约一百种有功能的DUBs。在过去的几十年中,UPS中其他组分在心脏内环境稳态和功能紊乱中作用已得到深入研究,而DUBs在心肌中的功能并未阐明。已有研究证明A20(也称为TNFAIP3)是心脏失代偿性重构和功能紊乱的负调控因子,但是泛素特异性蛋白酶(USP)15在心肌病中发挥介导作用。圆柱瘤蛋白(Cylindromatosis,CYLD)对K63连接的多聚泛素化具有高度特异的去泛素酶活性,并且能抑制NF-κB、MAPK和TGFβ信号通路,然而本课题组之前的研究表明CYLD可通过与NF-κB信号通路无关的机制对压力超负荷诱导的心肌病发挥重要的介导作用。这些发现强调了在心脏中不同DUBs的功能特异性,支持了 DUBs与底物接头蛋白、脚手架蛋白和抑制因子结合所形成的调节性相互作用引发其特异性的观点。尽管如此,各个DUBs在心脏内环境稳态和疾病中的重要功能尚不明确。自噬将细胞质组分,例如细胞器、蛋白聚集体或特定的单个蛋白运送至溶酶体进行降解,此分解代谢活动在不同物种间进化保守。完整的自噬是高度动态的过程,具有双层膜的自噬小体形成后,包裹目标待降解物质,随后自噬小体和溶酶体融合,形成自噬溶酶体,继而发生自噬溶酶体降解(自噬溶酶体外排)。自噬在心脏中的作用仍有争议。根据应激的性质和检测时机的不同,在心脏中激活自噬有时是保护性的,有时是损伤性的。最近的研究已经表明,在压力超负荷的心脏中自噬的激活很有可能是适应性反应。然而,目前仍缺少在压力超负荷的成体心脏中自噬介导心脏保护作用的确凿证据。近来研究表明,自噬底物和蛋白组分的泛素化修饰在自噬引发到终止的多个阶段发挥作用,成为自噬的中心调控机制。因此,可以预想DUBs对自噬具有调节作用。泛素标签如何通过改变蛋白信号和指引调节性蛋白降解来调控自噬尚未阐明。另外,在控制自噬时,将K63或K48连接的多聚泛素链加到自噬蛋白组分上的E3s和具有相反作用的DUBs之间的交互对话也没有研究清楚。目前,DUBs在心脏中调节自噬的病理生理相关性尚无报道。我们的研究证明,CYLD在心肌细胞自噬溶酶体外排阶段抑制自噬,因而加剧压力超负荷引起的心脏病理性重构和功能紊乱。这些结果揭示了 CYLD作为应激心脏中自噬抑制因子的新作用,第一次为DUBs介导的自噬调节和心肌病的直接关联提供了证据。研究目的:1、研究心肌特异性过表达CYLD在压力负荷引起的心脏重构和功能紊乱中的作用;2、研究心肌特异性过表达CYLD在压力负荷心脏中对泛素化蛋白积累和自噬功能的影响;3、确定在压力超负荷的心脏中激活自噬对心脏具有保护作用;4、探讨在压力超负荷背景下CYLD调节自噬,进而影响心脏重构和功能的具体机制。研究方法:1、对心肌特异性过表达CYLD转基因小鼠、心肌特异性过表达ATG7转基因小鼠、心肌特异性CYLD和ATG7双重过表达转基因小鼠、CYLD敲除小鼠和野生型对照组小鼠实施主动脉弓缩窄术(TAC),建立压力超负荷动物模型,分析术后存活率,通过超声心动图检测心功能,通过病理学检测,包括EBD染色、qPCR、WGA染色、Masson染色和TUNEL法评价心脏重构状况;2、通过Western blot检测心肌特异性过表达CYLD转基因小鼠和野生型对照组小鼠TAC术后心脏中泛素化蛋白积累、自噬流、自噬过程相关的蛋白表达水平;使用透射电子显微镜观察心脏中的自噬性小泡;3、在体外通过Western blot检测对照组细胞和CYLD敲除细胞中的自噬流,通过瞬时转染mCherry-GFP LC3报告质粒和带HA-Flag标签的Cyld质粒分析CYLD在细胞自噬流和自噬溶酶体外排中的作用。4、在体外运用碘化丙啶染色和乳酸脱氢酶活性测定检测CYLD敲除和过表达对细胞死亡的影响。研究结果:1、心肌特异性过表达CYLD加剧压力超负荷引起的心肌病;2、心肌特异性过表达CYLD加剧心脏中K48连接的泛素化蛋白的积累,恶化压力超负荷引起的自噬功能不全;3、通过心肌特异性过表达ATG7激活自噬保护心脏,抵抗压力超负荷引起的心肌病;4、在压力超负荷背景下,上调心肌CYLD的表达将ATG7依赖的心脏保护作用转变为ATG7介导的心肌病;5、心肌细胞中CYLD在自噬溶酶体外排阶段抑制自噬;6、CYLD抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体1(mTORC1)的再激活、上调大鼠脑组织Ras基因蛋白7(Rab7),加剧压力超负荷心脏中心肌细胞的死亡。研究结论:1、CYLD在心肌细胞中抑制自噬溶酶体外排,是心脏病理性重构和功能紊乱的新型介导因子。2、在机制方面,CYLD有可能通过削弱心肌细胞中mTORC1的再激活、阻断Rab7从自噬溶酶体释放,抑制自噬溶酶体外排。