研究背景和意义:视网膜血管发育初期,星形胶质细胞为内皮细胞搭建生长的骨架结构,供其茎细胞增殖攀附、尖端细胞良好出芽。而内皮细胞同样也可分泌重要因子调节星形胶质细胞的成熟发育,这对于其结构形成的稳定性至关重要。这两者之间独特的相互影响相互制约关系,被称为视网膜血管内皮-神经胶质单元,其稳定发展是整个视网膜网络结构发育的重要环节。Yes相关蛋白(YAP)作为HIPPO通路下游重要的核转录因子,已被证实是早期视网膜血管发育的重要调控因子,内皮细胞特异性YAP缺失将造成血管发育的停滞。除此之外,本课题早期研究表明,内皮细胞特异性YAP缺失不仅造成内皮细胞本身发育的减缓,还影响了星形胶质细胞网络的发育,导致星形胶质细胞的成熟化降低等。由于白血病抑制因子及其受体(LIF-LIFR)在内皮细胞-神经胶质单元中的重要作用,即内皮细胞分泌LIF作用于星形胶质细胞的LIFR后,影响星形胶质细胞的成熟分化过程,但其具体机制尚不清楚。所以我们认为,YAP可能在这一过程中发挥了重要作用。本课题组希望通过观察内皮细胞YAP敲除后星形胶质细胞成熟化发育受损这一现象,揭示YAP通过影响内皮细胞LIF分泌调节星形胶质细胞成熟这一过程的机制,并通过体外内皮细胞-星形胶质细胞共培养体系验证这一过程。本课题的研究意义在于,维持视网膜内皮细胞-星形胶质细胞单元的稳定发展不仅对发育早期视网膜网络结构发展及其重要,还可将这一研究结果应用于视网膜血管新生性疾病,如早产儿视网膜病变(ROP)的OIR模型中。通过稳定的星形胶质细胞网络结构发展,为疾病模型中过度增殖的血管内皮提供良好的增长环境,矫正其由于新生血管过度增生带来的一系列出血,渗漏等问题。从不同于血管生长因子(VEGF)等的研究方向解决视网膜新生血管这一棘手的问题,为临床治疗提供新的治疗思路。目的:1、探索发育阶段YAP在视网膜中的时空定位和表达含量;研究内皮细胞特异性YAP敲除小鼠的血管生长停滞即星形胶质细胞的抑制表型。2、证实内皮细胞YAP缺失导致的星形胶质细胞发育迟缓是由于未成熟星形胶质细胞增多所引起,而导致未成熟和成熟星形胶质细胞比例失衡的原因是LIF分泌减少。3、通过体外内皮细胞和星形胶质细胞共培养体系,证实内皮细胞中YAP的增多或减少的确改变了LIF的分泌,从而影响星形胶质细胞的表达。4、建立OIR模型,证实内皮细胞YAP的缺失会造成更加严重的血管问题,并且伴随星形胶质细胞骨架形态的异常且与星形胶质细胞未成熟化增多有关。5、对OIR小鼠给予外源性YAP激动剂(Y27632),证实星形胶质细胞骨架形态恢复,成熟化细胞增多伴随血管异常增殖情况好转。6、体外证实OIR模型中YAP敲除鼠导致的星形胶质细胞成熟分化改变也与LIF分泌较少有关。7、体外共培养模型证实,YAP-LIF-LIFR轴的相关性。方法:1、将母代的Tek-cre小鼠与YAP flop小鼠进行配种,得到第二代小鼠Tek-cre;YAPf/w,再由第二代鼠进行繁衍,最终得到:Tek-cre;YAPf/w,Tek-cre;YAPf/f,YAPf/f或者YAPf/w,分别记为杂合,纯合和WT鼠。每次实验采取同窝小鼠内比较,保证实验一致性。2、取E16,P0,P3,P7,P14,P21为发育中的重要时间节点,通过取材视网膜,行全视网膜铺片免疫荧光染色,视网膜冰冻切片免疫荧光染色,以及Westernblot检测蛋白表达等。3、建立OIR模型。取生后7天小鼠(同窝)与母鼠一同至于高氧氧舱内(75±5%氧浓度),至12天时取出。记P12为第一个时间节点(高氧组),并实验一部分小鼠;余小鼠继续于常氧中培养至17天,记P17为第二个时间节点(缺氧组),进行实验。实验内容包含:全视网膜铺片免疫荧光染色,视网膜冰冻切片免疫荧光染色,以及Westernblot检测蛋白表达。4、体外共培养星形胶质细胞和微血管内皮细胞(HMEC-1)。取出生后24小时内的小鼠,提取其脑皮质中的星形胶质细胞,于24孔板爬片上,培养3-5天;同时培养微血管内皮细胞株于6孔板中。当星形胶质细胞融合度达40%-50%左右时,将爬片放入含有内皮细胞株的6孔板中,实现共培养。5、体外共培养实验通过细胞免疫荧光染色,Westernblot测蛋白表达等方法,检测内皮细胞和星形胶质细胞不同的特异性标记物表达。通过两组不同实验:内皮细胞敲低YAP后加入LIF蛋白和内皮细胞YAP过表达后星形胶质细胞LIFR受体敲低来验证YAP与LIF-LIFR轴之间的逻辑关系。结果:1、视网膜发育各时间点WB结果和免疫荧光共定位显示:YAP大量定位于视网膜RGC层的内皮细胞中,少量表达与星形胶质细胞,且随发育时间的增加,YAP表达逐渐减少;而全视网膜铺片结果显示视网膜中内皮细胞和星形胶质细胞的确存在相互伴行依存关系。2、与WT小鼠相比,内皮细胞YAP特异性敲除鼠的杂合和纯合均出现不同程度的内皮细胞发育减缓,出芽减少,管腔稀疏等,同时伴有成熟星形胶质细胞的发育延缓,结构稀疏,而未成熟星形胶质细胞特异性标记物表现为增多,成熟与未成熟星形质细胞比例失衡。3、体外共培养星形胶质细胞和内皮细胞显示,改变内皮细胞的YAP表达可以不同程度的改变星形胶质细胞标记物的表达。除此以外,调节内皮细胞与星形胶质细胞成熟的中间分子LIF,也与YAP在发育阶段密切相关。4、建立OIR模型,发现与WT小鼠相比,内皮细胞YAP特异性敲除鼠出现明显的中央血管无灌注区加大且新生血管明显增多,并伴有星形胶质细胞纤维瘤样改变。体外给与小鼠YAP激动剂可以有效增多中央血管,减少新生血管过度增殖,且未成熟星形胶质细胞与成熟星形胶质细胞之间的比率下降,星形胶质细胞网络结构更加稳定,纤维化降低。5、OIR模型中小鼠视网膜形态的改变也与内皮细胞中YAP调节LIF分泌有关,外源性给与YAP激动剂后,LIF表达增多,成熟星形胶质细胞增加而未成熟星形胶质细胞减少。6、体外星形胶质细胞和内皮细胞共培养,通过改变内皮细胞YAP后,再外源性给与LIF或阻断LIFR,可以揭示YAP-LIF-LIFR轴之间的相关性。结论:本课题不仅揭示了内皮细胞中的YAP在视网膜血管发育阶段扮演了重要的作用,还通过影响LIF-LIFR轴对血管-神经单元的稳定性起了调节作用。这是视网膜血管和神经发育的重要发现,并将这一发现应用于视网膜血管的疾病模型中,通过维持疾病状态下成熟星形胶质细胞的稳定发展,进而改变异常增生的新生血管,减少血管的渗漏,从不同于抑制血管生长因子的角度,为治疗视网膜新生血管性疾病提供了新的理论依据。