米曲霉被美国食品药物管理局（FDA）列为公认安全级（GRAS）菌株,是异源蛋白的重要表达体系,同时也是传统发酵工业的重要丝状真菌。米曲霉是一种典型的半知菌,其孢子有多种核型（大多数为多核,少数为单核）,而这种多核特性也给菌株改造和工业育种带来了挑战。在对菌株改造的过程中,极有可能得到异核体转化子,而异核体的存在也会导致重组蛋白表达水平的下降以及传代过程中目的基因的丢失;而在工业育种过程中多核特性会稀释遗传操作产生的表型效应。为了解决这一困境,找到一种能够得到单孢纯合子的方法是迫切需要的。一般通过单孢分离的方法获得纯合子。目前,分离得到单孢子的方法主要有单孢直接挑取分离法、膜过滤富集单核孢子、毛细管电泳、以及基于微流控平台的被动分选方法等。本论文通过将微流控被动分选中的惯性聚焦和确定侧向位移两种结构结合起来通过逐级分选的方式实现了对米曲霉H4单核分生孢子的高通量高精度的分选。该方法也为米曲霉遗传改造难以得到纯合子的困难提出了解决办法。本研究的主要内容如下:1.米曲霉H4分生孢子的核型分析:对米曲霉分生孢子进行DAPI核染色,探究得到米曲霉H4的分生孢子有四种核型,分别为单核、双核、三核及四核。进一步对其核内形态进行分析,发现三核内核的排列方式有两种形态,一种呈曲线型贴壁排列,另一种以等边三角形的形态排列。对照明场图及其对应的荧光图,利用Nano Measure软件对米曲霉分生孢子的直径进行测量,并对单核、双核以及全部孢子做直径的频数分布图。最终探究得到在麦芽汁培养基上收集得到的分生孢子直径主要分布在2～6μm;其直径和核内数目存在一定的正比关系;并且3μm以下的单核孢子的比例为8.1%。同时进一步探究了肌醇对米曲霉单核率的提升效果,以同样DAPI核染色的方法发现在肌醇培养基上收集到得到的3μm以下的单核孢子比例提升到34.4%。证明肌醇确实对单核率的提升有一定效果。2.依据惯性聚焦以及确定性侧向位移两种结构的基础理论设计应用于单核分生孢子分选的微流控芯片:依据惯性聚焦以及确定性侧向位移的理论以及经验公式并结合本实验的分选目的设计出一组用于分离得到3μm以下单核孢子的二级微流控分选结构。本文首先利用了初始半径为3 mm,横截面为100×50μm（w×h）,流道间距为250μm,总螺旋数为5圈的一级螺旋型惯性聚焦对分生孢子悬液中的大于3.5μm直径较大的杂质以及分生孢子进行高通量的分离,期望得到直径小于3.5μm以下的分生孢子。为了进一步提高目标粒子的纯度将经一级分选结构收集到的目标粒子再接入一个DC等于3μm,ε为0.05,柱间距G为9μm,微柱直径为25μm的拥有高精度分选特点的二级确定性侧向位移结构。3.利用刚性的聚苯乙烯微球对两种结构的分选性能进行表征:在进行实际生物粒子的分选试验之前,首先利用形状规则且不易变形的刚性聚苯乙烯微球,对惯性螺旋聚焦芯片以及确定性侧向位移芯片进行分选性能的表征。为了准确的表征粒子在各个出口的分布以及分选芯片的分选效果,本文从粒子浓度和速度这两个主要影响分选性能的方面出发,从不同条件下目标粒子的回收率探究出最适粒子分选的条件,再利用不同直径聚苯乙烯微球模拟实际生物样品中不同直径粒子的比例,从回收率,纯度,富集因子三个方面对二级分选结构的分选能力进行表征。经探究得到最适的进行粒子分选的条件为:浓度为10~7个/m L,速度为18 m L/h的条件下经过一级分选目标出口处目标粒子的回收率为17.42%、纯度为90%、富集因子为17.5;浓度为10~6个/m L,速度为60μL/min经过二级分选之后目标出口处目标粒子的回收率为85.42%、纯度为100%、富集因子为11.1。经试验证明,本文设计的二级结构可以实现对3μm以下单核分生孢子的高通量高精度的分离。4.利用农杆菌介导的转化将脂肪酶基因转化到米曲霉H4中并利用微流控二级分选结构分选得到单核转化子:在使用刚性的聚苯乙烯微球对惯性聚焦和确定性侧向位移二级结构进行了分选性能表征之后,按照优化好的条件对实际生物粒子米曲霉H4的分生孢子进行分选。并对各处口分选得到的粒子进行DAPI核染色对分选效果进行验证。验证得到的结果与刚性聚苯乙烯微球的分选效果基本是一致的。利用农杆菌介导的转化对米曲霉进行遗传改造,将带有绿色荧光报告基因的脂肪酶基因转入米曲霉H4中,初筛得到异核体,之后收集肌醇培养基上的分生孢子异核体再利用本文所设计的二级分选结构进行逐级分选,最终得到单核纯合子。为了比较纯合子和杂合子之间的差异,又对其进行发酵培养并取浓缩后的粗蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳验证,可粗略推测得出纯合子的脂肪酶表达量高于杂合子的结论。