【摘 要】
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食品在生产、加工、包装、销售、烹调等众多环节都可能被食源性致病菌污染,食源性致病菌已经成为引起食品安全问题的重要因素。副溶血性弧菌、非O1/O139群霍乱弧菌以及河流弧菌都是常见的食源性致病菌,误食后轻则使人腹泻腹痛,严重时甚至会造成死亡。目前其检测方法大多存在所需时间久,需要复杂、昂贵的检测设备以及操作繁琐的问题,因此急需建立一种方便快捷的方法来检测这些食源性致病菌。免疫磁珠分离（Immunom
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食品在生产、加工、包装、销售、烹调等众多环节都可能被食源性致病菌污染,食源性致病菌已经成为引起食品安全问题的重要因素。副溶血性弧菌、非O1/O139群霍乱弧菌以及河流弧菌都是常见的食源性致病菌,误食后轻则使人腹泻腹痛,严重时甚至会造成死亡。目前其检测方法大多存在所需时间久,需要复杂、昂贵的检测设备以及操作繁琐的问题,因此急需建立一种方便快捷的方法来检测这些食源性致病菌。免疫磁珠分离（Immunomagnetic separation,IMS）技术将磁珠的优点与免疫学反应的高度特异性特点结合起来,可以将目标菌从复杂的样品基质或增菌液中直接分离、富集出来,有效地消除了基质干扰、有利于检测效率的提高,是对样品进行前处理的一种简单有效的方法。本文所用的单克隆抗体VF-H11与副溶血性弧菌、非O1/O139群霍乱弧菌、河流弧菌等均有结合活性,将其与磁珠偶联后,可以对多种弧菌进行捕获。环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）方法具有特异性强、扩增效率高、反应快速、检测方法简单以及无需复杂设备等特点,非常适合对食源性致病菌进行快速检测。本研究将免疫磁分离技术与环介导等温扩增方法结合起来,建立了食源性致病菌的免疫磁分离-环介导等温扩增（IMS-LAMP）检测方法,具有简便、快速、灵敏度高、便于现场检测的特点。具体的实验结果如下:（1）建立副溶血性弧菌、非O1/O139群霍乱弧菌及河流弧菌免疫磁分离方法。采用聚乙烯亚胺-戊二醛介导系统合成免疫磁珠,副溶血性弧菌免疫磁珠、非O1/O139群霍乱弧菌免疫磁珠及河流弧菌免疫磁珠制备时,1 mg 250 nm羧基化磁珠的最佳抗体添加量分别为125、100、100μg。同时对副溶血性弧菌免疫磁珠、非O1/O139群霍乱弧菌免疫磁珠及河流弧菌免疫磁珠的富集条件进行了优化,最佳的免疫磁珠添加量分别为0.6、0.6、0.8 mg,最佳捕获时间均为45 min。当杂菌浓度高于目标菌约10倍时,其捕获效率几乎不变,有较强的抗干扰能力,同时当体系中菌液浓度为10~2 CFU/m L时,仍然能够捕获,具有良好的灵敏度。（2）建立副溶血性弧菌、非O1/O139群霍乱弧菌及河流弧菌环介导等温扩增检测方法。通过NCBI数据库选取常见弧菌的Tox R蛋白序列,经过多序列比对后选择可变区的蛋白序列,进一步确定核酸序列后通过在线网站https://primerexplorer.jp/e/index.html设计特异性的扩增引物并对引物进行筛选,之后通过优化反应过程中的Mg2+浓度、酶浓度、反应温度及反应时间等条件,建立LAMP反应体系,并对各引物的特异性及灵敏度进行检测。结果表明副溶血性弧菌LAMP最优反应体系如下:6 m M Mg2+,0.32 U/μL酶,反应温度63.5℃,30 min扩增时间;非O1/O139群霍乱弧菌LAMP最佳反应体系如下:4 m M Mg2+,0.32 U/μL酶,反应温度60.3℃、30 min扩增时间;河流弧菌LAMP最优反应体系如下:4 m M Mg2+,0.24 U/μL酶,反应温度为63℃、40 min扩增时间。三种体系具有良好的特异性,副溶血性弧菌、非O1/O139群霍乱弧菌以及河流弧菌纯培养物的灵敏度分别为1.9×10~0、6.2×10~1、7×10~0CFU/m L。（3）副溶血性弧菌、非O1/O139群霍乱弧菌及河流弧菌免疫磁珠-环介导等温扩增检测方法的建立。将之前建立的免疫磁分离方法与环介导等温扩增检测方法结合起来,使用荧光染料SYTO-9实现对检测结果的可视化检测。对水样及鱼样的检测灵敏度及反应的特异性进行研究。实验结果表明建立的IMS-LAMP检测方法具有良好的特异性。琼脂糖凝胶电泳结果表明副溶血性弧菌、非O1/O139群霍乱弧菌及河流弧菌的水样检测灵敏度分别为1.2×10~1、2.5×10~1、4.1×10~0 CFU/m L,鱼样检测灵敏度分别为3.2×10~3、2.5×10~2、4.1×10~1CFU/m L。使用荧光染料SYTO-9后,副溶血性弧菌、非O1/O139群霍乱弧菌及河流弧菌的水样检测灵敏度分别为1.2×10~0、2.5×10~0、4.1×10~0 CFU/m L,鱼样检测灵敏度分别为3.2×10~1、2.5×10~1、4.1×10~0 CFU/m L。荧光染料的使用使检测的灵敏度提高了10-100倍。
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