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目的:牙源性疼痛是一种常见的口腔颌面部疼痛,其发病率高,包括急性和慢性疼痛,严重时可影响患者的饮食睡眠情绪。由于牙髓组织内神经分布的特殊性,疼痛常不能准确定位。颌面部疼痛与躯体疼痛的大脑神经传导机制不同,而牙髓伤害性刺激在大脑皮层的定位与代谢分布仍存在争议。根据文献调研结果发现,前扣带皮层（ACC）作为疼痛处理区域,参与急慢性疼痛的神经传导机制。ACC分为吻侧ACC（rostral anterior cingulate cortex,rACC）和尾侧ACC（caudal anterior cingulate cortex,cACC）。rACC通过调节NMDA受体亚基NR1、NR2B和NR2A磷酸化水平在疼痛和情绪方面起关键作用,NMDA受体拮抗剂APV可逆转亚基磷酸化水平。有害刺激可导致cACC脑区NMDA受体激活,然而cACC脑区NMDA受体亚基NR1、NR2B和NR2A参与疼痛的具体机制尚不明确。有研究证实了cACC脑区是参与三叉神经疼痛的关键区域,课题组前期研究通过micro-PET影像结果显示牙髓疼痛大鼠（Dental pulp injury,DPI）术后3d cACC脑区Cg1区完全激活,可能参与了牙源性疼痛的传导。因此,本研究在课题组前期研究的基础上,选取DPI术后3d作为研究时间点,通过大鼠擦面与强迫游泳实验的行为学评估,研究APV是否可逆转大鼠牙源性疼痛相关的行为;并通过Western Blot、激光共聚焦免疫荧光技术研究APV是否可逆转NMDA受体亚基磷酸化水平;最后采用micro-PET影像技术明确DPI术后3d APV是否可抑制cACC脑区葡萄糖的代谢,进一步探讨大鼠cACC区NMDA受体在牙源性疼痛中的神经传导机制。方法:1.cACC脑区埋置给药管脑立体定位仪的协助下,根据坐标位点进行cACC脑区埋置给药管。术后抗感染恢复一周后,cACC脑区微量注射墨汁确定给药管的位置是否准确。2.构建DPI大鼠模型随机选取60只雄性SD大鼠,腹腔麻醉后,采用高速涡轮机及1/2圆钻于上颌第一磨牙近中窝处间歇性磨除牙体硬组织,暴露髓腔形成不可逆性牙髓源性疼痛。随机分为四组:（1）SHAM组（n=12）:不做任何处理;（2）DPI组（n=12）:单纯构建DPI模型;（3）DPI+NS组（n=18）:cACC脑区注射生理盐水;（4）DPI+APV（n=18）:cACC脑区注射APV。3.放射自显影筛选APV浓度埋置给药管术后恢复一周左右,cACC区注射不同浓度APV:2nmol/μl、8nmol/μl、10nmol/μl、15nmol/μl,进行[18F]-FDG放射自显影检测。4.行为学评估构建DPI大鼠模型术前连续2d至术后连续3d,进行大鼠体重、饮食和饮水测量。安静环境下,采用自制的擦面录像装置,录取20min内大鼠擦面的总时间;游泳装置内水位以大鼠尾巴不碰底为准,记录5min内大鼠静止不动的时间。cACC注射APV 1h后的行为学评估方法同前。5.免疫荧光技术检测cACC脑区c-Fos及NMDA受体亚基的表达腹腔麻醉大鼠,多聚甲醛灌注取大鼠脑组织。激光共聚焦免疫荧光技术检测DPI1-3d cACC冰冻脑组织c-Fos、NR1、NR2A、NR2B的表达情况。6.Western Blot检测cACC脑区NMDA受体亚基磷酸化水平腹腔麻醉,取新鲜脑组织,提取cACC脑组织蛋白,Western Blot技术检测DPI术后1d、2d、3d、7d、14d cACC脑区NR2A亚基磷酸化表达。异氟烷轻度麻醉,微量注射APV1h后处死大鼠,取新鲜cACC脑组织并提取蛋白,Western Blot技术检测DPI3d cACC脑区NR2A、NR2B亚基磷酸化水平及c-Fos的表达情况。7.Micro-PET影像技术观察cACC脑区葡萄糖的代谢变化随机从每组选取6只大鼠,cACC微量注射APV 20min后,行腹腔注射[18F]-FDG,待吸收40min后,异氟烷轻度麻醉放置micro-PET扫描仪进行10min静态图像扫描,图像重建,PMOD软件分析葡萄糖代谢率。结果:1.墨汁实验准确定位cACC脑区给药管位置脑立体定位仪与微量注射泵协助下,cACC区注射墨汁10min后,处死大鼠,取出脑组织,沿注射部分切取脑组织的冠状面,观察墨汁位置与cACC脑区位置一致,说明给药管埋置准确。2.DPI模型构建及评估DPI术前2d至术后3d,一般行为学结果显示DPI3d大鼠的体重、饮食和饮水均显著减少,差异具有统计学意义（P<0.05）。大鼠擦面的行为学结果显示DPI术后擦面的总时间增多（P<0.05）,强迫游泳结果显示大鼠静止不动的时间明显延长（P<0.05）。以上结果说明DPI大鼠模型成功构建,DPI3d大鼠存在疼痛和抑郁行为,与前期结果一致。激光共聚焦免疫荧光结果显示DPI 1-3d cACC脑区c-Fos高表达,说明外界伤害性刺激传导至大脑皮层。3.NMDA受体亚基NR1/NR2A/NR2B参与DPI3d大鼠cACC表达激光共聚焦免疫荧光结果显示DPI3d cACC脑区NR1、NR2A、NR2B呈高表达,说明NMDA受体参与了DPI大鼠急性疼痛cACC脑区的传导。Western Blot检测DPI1d、2d、3d、7d、14d cACC区NMDA受体亚基NR2A磷酸化表达水平,结果显示DPI3d cACC区NR2A磷酸化水平表达最多,差异有统计学意义（P<0.05）,表明急性牙髓源性疼痛时可上调NMDA受体NR2A磷酸化水平。4.放射自显影技术确定APV最佳浓度为10nmol/μl[18F]-FDG放射自显影结果显示,与APV浓度为2nmol/μl、8 nmol/μl、15nmol/μl相比,cACC脑区注射10 nmol/μl APV可抑制cACC脑区的葡萄糖代谢。因此,本研究选取10 nmol/μl APV为后续实验的给药浓度。5.APV可逆转疼痛和情绪相关行为DPI大鼠术后3d,cACC注射APV 1h后进行大鼠擦面行为的检测,结果显示与SHAM、DPI、DPI+NS组相比,DPI+APV组大鼠擦面时间明显缩短（P<0.05）。说明APV可能作用于cACC脑区NMDA受体,进而缓解大鼠疼痛行为。DPI大鼠术后3d,cACC注射APV 1h后,进行强迫游泳实验,结果发现DPI+APV组大鼠游泳时静止不动的时间较DPI、DPI+NS组明显缩短（P<0.05）,表明APV作用于cACC脑区可能抑制大鼠抑郁情绪。6.APV可抑制cACC葡萄糖代谢水平Micro-PET影像技术检测DPI3d cACC区注射APV1h后,观察[18F]-FDG代谢变化,PMOD分析结果显示,与SHAM、DPI、DPI+NS组相比,DPI+APV组大鼠cACC葡萄糖代谢被抑制,具有统计学差异（P<0.05）。说明DPI3d cACC脑区注射APV可能抑制NMDA受体,从而抑制葡萄糖代谢。7.APV可下调cACC脑区NMDA受体亚基NR2A/NR2B磷酸化水平,并可下调c-Fos表达Western Blot实验结果显示与DPI和DPI+NS组相比,DPI+APV组NR2A NR2B的磷酸化水平降低,结果具有统计学差异（P<0.001）。然而NMDA亚基NR1的表达无明显差异（P<0.001）。另外,我们还发现cACC脑区注射APV后可降低疼痛标志分子c-Fos的表达（P<0.001）。本实验结果说明APV可下调cACC脑区NR2A、NR2B磷酸化水平,并可下调c-Fos的表达。结论:本研究通过成功构建的DPI大鼠模型,证实了NMDA受体可能参与了急性牙髓源性疼痛cACC脑区的神经传导机制。NMDA受体拮抗剂APV可能逆转了大鼠的疼痛和抑郁情绪。APV可能作用于cACC NMDA受体发挥作用,抑制葡萄糖的代谢,可能是通过逆转NMDA受体NR2A、NR2B磷酸化水平参与疼痛。本研究为牙源性疼痛的神经传导机制提供了指导意义,并进一步为临床治疗提供更多的思路。然而NR1磷酸化表达如何值得进一步研究。