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研究目的：非霍奇金淋巴瘤（NHL）是最常见的淋巴系统恶性肿瘤，好发于青壮年，其中绝大多数为B细胞来源，约占85%。CD20分子在95%以上的B细胞性NHL中均有表达，且抗原分子在膜上比较暴露，容易接近，与单抗结合后无显著内化和脱落，也不会因与抗体的结合而发生抗原调变，因此成为治疗B细胞淋巴瘤的理想靶点。目前已有人鼠嵌合抗CD20抗体上市（Rituximab-C2B8）。尽管Rituximab在临床治疗中已显示出较好的疗效，仍有部分的患者对Rituximab的治疗不产生反应，且单独使用该药治愈率仅为10％，大部分患者会产生复发和抵抗，并且具有产生人抗鼠抗体（HAMA）反应的潜在风险。基于此，本实验室重新构建并表达了全新的重组抗CD20人源化单克隆抗体，以期进一步提高抗体的功能，降低HAMA反应的风险。本研究首次通过超高压液相色谱串联四级杆飞行时间质谱（LC-ESI-Q-Tof）技术从不同水平对重组抗CD20人源化单克隆抗体的结构进行了详细的分析鉴定，并进行了体外生物活性的分析，为下一步的临床前和临床研究奠定了良好基础。研究方法：SDS-PAGE和HPLC-SEC分析重组抗CD20人源化单克隆抗体的表观分子量和纯度。LC/MS在完整蛋白水平上分析重组抗CD20人源化单克隆抗体的精确分子量及主要的翻译后修饰种类。LC/MS在抗体轻、重链水平上分析重组抗CD20人源化单克隆抗体轻、重链的精确分子量及主要的翻译后修饰种类。LC/MS分析重组抗CD20人源化单克隆抗体的质量肽图谱，对其一级结构进行匹配，标定糖基化位点，并确认抗体的主要翻译后修饰类型。LC/MS分析重组抗CD20人源化单克隆抗体的糖基化修饰类型，对游离寡糖进行鉴定，分析各糖形的比例分布。体外测定重组抗CD20人源化抗体的ADCC和CDC效应，直接诱导细胞凋亡的作用以及抗体与CD20抗原的亲和力。研究结果：SDS-PAGE及HPLC-SEC分析结果显示，重组抗CD20人源化单克隆抗体分子量与理论分子量一致；经过ProteinA亲和层析及疏水层析，HPLC纯度可达99%以上，有少量的多聚体存在。PNGaseF酶切去除N糖基化修饰后的完整抗体的精确分子量为145424.92Da，与理论分子量一致。还原状态下，PNGaseF酶切前后，重链的精确分子量分别为50671.28Da和49226.75Da，轻链分子量均为23489.18Da，证实轻链不存在N糖基化的翻译后修饰，重链则存在N糖基化修饰。LC-MS质量肽图谱分析结果显示，一级覆盖率为100%，MSE二级覆盖率为96.7%（b，y≥3），一级结构与理论序列完全一致。糖基化位点位于重链第301位的Asn。正相超高效液相色谱质谱（NP-UPLC-MS）分析共发现并确认的糖形为32种，以二天线复杂型糖形为主，有少量高甘露糖形，以及少量去岩藻糖化糖形，其中G0和G0F的比例分别为6.54%和45.96%。在体外功能分析结果显示，重组抗CD20人源化单克隆抗体的ADCC、CDC、直接诱导细胞凋亡的作用和亲和力均优于Rituximab。