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5-磷酸烯醇式丙酮酸-3-磷酸莽草酸合成酶（EPSPS）是草甘膦的靶标酶，转基因抗草甘膦作物主要通过转入外源 EPSPS基因来培育。抗草甘膦基因(EPSPS)的克隆、表达及其功能验证等是现代植物分子育种研究的重点。因此，加大挖掘相关基因资源和基因改造力度，对进一步获取具有独立知识产权的抗草甘膦新基因有重要意义。 本研究从华南地区的农田和水体中采样，并对样品进行草甘膦处理，用含不同浓度梯度的草甘膦选择性培养基分离得到1株草甘膦抗性细菌和3株抗性真菌。通过对抗性菌株的形态观察和基于16S rDNA序列、ITS序列分析的系统发育分类方法，鉴定出该抗性细菌为肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，暂定名为 kpS001；鉴定出3株抗性真菌分别为淡紫拟青霉(Paeciloomyces lilacinus)、多变根毛霉(Rhizomucor variabilis)和黄曲霉(Aspergillus flavus)，分别命名为F35，F37，F62。 克隆出肺炎克雷伯氏菌kpS001的 aroA基因，命名为aroAS001对其序列进行分析，发现 aroAS001基因片段长度为1284bp，在氨基酸序列的91-98和第175-183位有EPSP酶功能保守序列-L-G-N-A-G-T-A-和-A-L-L-M-T-A-P-L-A-。将该氨基酸序列与 NCBI中 Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae NTUH-K2044全长aroA基因编码的氨基酸序列相比，其编码的氨基酸序列的第76位发生变异，由苏氨酸突变为异亮氨酸，推测该位点的变化可能是导致肺炎克雷伯氏菌kpS001菌株对草甘膦抗性增强的原因之一。 用pProA载体构建重组质粒pProA-aroAS001，转入aroA缺陷性大肠杆菌菌株DH5α（DH5α/△aroA）得到目标重组菌。通过诱导该菌的蛋白表达，发现目的蛋白在重组菌中有特异表达，大小约为48kDa，与预期蛋白大小相符；然后将重组菌株接入到含不同浓度草甘膦的 M9基础盐培养基中培养，进行功能互补实验。实验结果显示，转入 aroAS001基因的重组菌株的生长状态明显优于对照组菌株；在含200mmol/L以下草甘膦的培养基中，重组菌的生长基本没有受到影响，随着草甘膦浓度增加，重组菌的生长逐渐受到抑制，但仍明显高于对照菌株，重组菌能够在350mmol/L草甘膦浓度的选择性培养基上生长，表明克隆出来的aroA基因是kpS001对草甘膦产生抗性的主要原因。