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肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma,ccRCC)是最常见的肾癌病理亚型,约占肾癌的70%-80%,其转移率可达60%,严重损害人类健康。上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)是肿瘤细胞发生转移的主要特征,参与肿瘤细胞的迁移与侵袭过程。虽然转化生长因子β(Transforming growth factor β,TGF-β)介导的EMT已得到广泛研究,但ccRCC进展过程脂质代谢异常与EMT介导的肿瘤细胞转移的关系尚不清楚。肿瘤细胞的脂质代谢异常主要表现为肿瘤细胞过多的吸收外源脂肪酸(Fatty acid,FA),合成内源FA以及脂肪酸氧化(Fatty acid oxidation,FAO)水平的降低,最终导致过度的脂质积累,从而促进肿瘤细胞的增殖、存活和转移。FAO过程主要分为线粒体途径和过氧化物酶体途径,分别介导不同链长的FA进入氧化程序。既往研究主要聚焦于线粒体途径FAO与肿瘤进展的关系,但过氧化物酶体FAO与ccRCC转移潜能的关系尚不清楚。本研究首先通过癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atla,TCGA)数据库确认过氧化物酶体FAO途径的限速酶—酰基辅酶A氧化酶1(Acyl-Coa oxidase 1,ACOX1)的低表达与ccRCC的生存期减少相关。进一步研究结果表明,ccRCC中ACOX1的低表达诱导脂质积累,进一步通过上调哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号途径促进ccRCC细胞的增殖与EMT,最终促进ccRCC细胞的生长与转移。目的:明确ACOX1低表达对ccRCC细胞增殖与转移的促进作用,并探讨相关的分子机制方法:1.明确ACOX1与ccRCC增殖和转移的关系(1)通过TCGA数据库检测ACOX1表达水平与ccRCC患者的总生存期以及无疾病进展生存期的关系。(2)通过慢病毒转染的方法在ccRCC皮肤转移灶细胞系Caki-1中敲低ACOX1,构建shACOX1-Caki-1的稳转细胞系,并利用慢病毒携带的嘌呤霉素抗性基因筛低表达ACOX1的Caki-1细胞,对照组为空载慢病毒。(3)敲低ACOX1后检测细胞的迁移、侵袭和增殖能力①Western Blot检测shACOX1-Caki-1细胞EMT标记分子的表达水平②细胞迁移和侵袭实验检测shACOX1的Caki-1细胞迁移能力的改变。③细胞迁移和侵袭实验检测shACOX1的Caki-1细胞侵袭能力的改变④应用EDU和克隆形成实验检测沉默ACOX1后Caki-1细胞增殖水平。2.验证ACOX1通过诱导脂质积累促进Caki-1细胞的增殖和转移。(1)油红O检测试剂盒确定shACOX1-Caki-1细胞脂质积累水平。(2)敲低Caki-1细胞中负责转运FA进入过氧化物酶体的ABCD1基因,验证抑制过氧化物酶体FAO促进Caki-1细胞的增殖与转移。①慢病毒转染Caki-1细胞,筛选稳定敲低ABCD1基因的Caki-1细胞系,对照组为空载慢病毒。②通过油红O染色试剂盒检测shABCD1-Caki-1细胞的脂质积累水平。③Western Blot检测ABCD1和EMT标记分子的表达水平。④细胞迁移和侵袭实验检测shACOX1的Caki-1细胞迁移能力的改变。⑤细胞迁移和侵袭实验检测shACOX1的Caki-1细胞侵袭能力的改变⑥EDU试剂盒和克隆形成实验检测敲低ABCD1后,Caki-1细胞增殖水平。3.探究介导ACOX1沉默对Caki-1细胞增殖和转移促进作用的信号途径。(1)选取正常的肾小管上皮细胞HK-2细胞系,敲低ACOX1后和对照组细胞进行RNA-sequence检测,富集分析检测差异代谢途径。(2)验证mTOR信号介导shACOX1对Caki-1细胞增殖和转移的促进作用①Western Blot检测敲低ACOX1后的Caki-1细胞系的mTOR表达及其磷酸化的水平改变。②Western Blot检测敲低ABCD1后的Caki-1细胞系的mTOR表达及其磷酸化的水平改变。③mTOR信号抑制剂雷帕霉素处理shACOX1-Caki-1细胞。④Western Blot检测雷帕霉素处理后shACOX1-Caki-1细胞EMT标记分子的表达水平。⑤细胞迁移和侵袭实验检测雷帕霉素处理后shACOX1-Caki-1细胞迁移能力。⑥细胞迁移和侵袭实验检测雷帕霉素处理后shACOX1-Caki-1细胞侵袭能力。⑦EDU试剂盒和克隆形成实验检测雷帕霉素处理后对shACOX1-Caki-1细的增殖水平。结果:1.明确ACOX1与ccRCC增殖和转移的关系(1)TCGA数据库显著低水平表达ACOX1的ccRCC患者表现为更短的总生存期和无疾病进展生存期。(2)成功构建shACOX1-Caki-1的稳转细胞系。(3)敲低ACOX1后Caki-1细胞EMT相关分子表达水平增加,迁移、侵袭和增殖能力增强。2.验证ACOX1通过诱导脂质积累促进Caki-1细胞的增殖和转移。(1)相比对照组细胞shACOX1-Caki-1细胞中存在过度的脂质积累。(2)shABCD1-Caki-1细胞表现为过度的脂质积累、EMT标记分子表达水平上调、侵袭和转移能力增强以及增殖能力增加。3.探究介导ACOX1沉默对Caki-1细胞增殖和转移促进作用的信号途径。(1)富集分析结果显示shACOX1-Caki-1细胞中mTOR信号富集。(2)shACOX1加强Caki-1细胞的p-mTOR水平,雷帕霉素处理逆转沉默ACOX1对Caki-1细胞EMT、增殖和转移的促进作用。结论:1.肾透明细胞癌中ACOX1表达水平的降低促进肿瘤的增殖和转移;2.脂质积累的增加介导shACOX1对Caki-1细胞增殖和转移的促进作用;3.shACOX1所致的mTOR信号上调促进Caki-1细胞的增殖和转移。