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核苷酸切除修复(nucleotide excision repair,NER)是一类重要的DNA损伤修复方式。NER分为转录偶联的核苷酸切除修复(Transcription Coupled Repair,TCR)和全基因组修复(Global Genome Repair,GGR)。在酿酒酵母中,GGR对损伤位点的识别和切除主要由四种核苷酸切除复合物(nucleotide excisionfactor,NEF)完成。NEF2由Rad4和Rad23构成,负责识别损伤位点。NEF1和NEF3分别含有核酸内切酶Rad1和Rad2,负责在损伤位点两端切断DNA单链。NEF4包含Rad7和Rad16,是GGR必需的损伤修复因子;NEF4也能识别损伤DNA,并且具有重构染色质结构的能力。Rad7与Rad4相互作用,是连接NEF4和NEF2的桥梁。Elc1是人源转录延伸因子ElonginC在酿酒酵母中的同源蛋白,但Elc1没有促进转录延伸的功能,而是在GGR中发挥作用。Elc1能与Rad7相互作用,但目前并不明确Elc1参与GGR的作用机制是否与Rad7有关。泛素化是一种重要的蛋白质调节机制,可以调控蛋白的性质,例如改变蛋白在细胞内的分布、调节蛋白间相互作用等;泛素化最重要的功能之一是可以介导蛋白被蛋白酶体识别而降解。人源Elongin C结合Cullin和SOCS-box蛋白形成ECS(ElonginBC-Cullin-SOCS-box)型E3泛素连接酶。SOCS-box由BC-box和Cullin-box组成,其中BC-box结合Elongin C,Cullin-box结合Cullin。Elc1具有和Elongin C相似的结构和功能;Rad7能结合Elc1,并且具有与SOCS-box相似的序列;Rad16含有RING结构域,含RING结构域的蛋白在E3连接酶中用于结合E2。Elc1、Rad7、Rad16和Cul3被报道可以形成E3泛素连接酶,当细胞受到紫外损伤后泛素化Rad4。因此,Rad7和Elc1至少具有两方面的功能。首先,它们参与GGR;其次,Rad7/Elc1参与形成E3泛素连接酶,调控Rad4水平。 本论文重组表达和纯化了Rad7/Elc1复合物,发现它在溶液中以异源二聚体和异源四聚体形式存在,目前不清楚其聚合状态是否与其功能有关。我们获得了Rad7/Elc1复合物两种聚合状态下的晶体,并解析了Rad7165-565/Elc1△32-41异源四聚体2.3(A)晶体结构。在我们的结构模型中,Rad7165-565由一段长α螺旋(αL)和一个Leucine rich repeat(LRR)结构域组成。αL提供复合物双体形成的主要作用力。αL的N端为BC-box,通过疏水作用结合Elc1。在E3泛素连接酶体系中,Rad7被认为是含有SOCS-box的底物受体,然而,我们的结构显示,Rad7含有BC-box但不含有Cullin-box。但pulldown结果表明,Rad7/Elc1、Elc1、Rad7分别可以与Cul3直接相互作用。虽然目前我们还不清楚Rad7与Cul3的相互作用方式,但我们解析的结构显示Rad7/Elc1/Cul3的结构组成与ECS型E3泛素连接酶不同。 本论文的最后一章介绍了我在博士研究生阶段所做的另外两个课题,分别是酵母Elc1/Ela1/Cul3 E3泛素连接酶的结构生物学研究和染色质重构因子Fun30/Fft3的结构生物学研究。Elc1/Ela1/Cul3 E3泛素连接酶负责泛素化阻滞在DNA损伤处的RNA聚合酶。本论文分别表达、纯化了Elc1/Ela1复合物和Elc1/Ela1/Cul3复合物,并获得了它们的晶体,目前Elc1/Ela1晶体衍射数据分辨率为3.4(A),但缺乏相位信息,而Elc1/Ela1/Cul3晶体衍射能力较差。酿酒酵母Fun30和裂殖酵母Fft3同属于SNF2家族Etl1亚家族,是染色质重构因子,在DNA双链断裂修复和异染色质结构维持等方面发挥功能。我们表达并纯化了多个Fun30的截短体,但最终只解析了Fun30 ATPase C端(ATPase-C)的1.95(A)结构。与SNF2家族其它蛋白相比,Fun30 ATPase-C拥有一个helix-bundle结构,在Etl1亚家族内部保守。我们还对Fun30 ATPase-N和ATPase-C的聚集状态和对DNA的结合能力进行了探讨。另外,我们获得了Fft3包含有完整ATPase结构域的截短体的晶体,目前晶体仍需优化。这两个课题均只获得了部分结果,后续研究正在进行中。