【摘 要】
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MicroRNA（miRNA）是一类内源性且具有重要生物调控作用的短链非编码RNA分子。已有越来越多的证据表明miRNA的作用不仅局限于发育调控,其异常表达还与多种疾病,尤其是癌症的发生和发展密切相关。因此,将miRNA作为一种重要的生物标志物,检测其在特定组织或细胞中的表达变化,可以为疾病的诊断、预后和预测提供依据,具有潜在的临床应用前景。目前大多数miRNA检测方法局限于体外定量检测,无法获取
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MicroRNA（miRNA）是一类内源性且具有重要生物调控作用的短链非编码RNA分子。已有越来越多的证据表明miRNA的作用不仅局限于发育调控,其异常表达还与多种疾病,尤其是癌症的发生和发展密切相关。因此,将miRNA作为一种重要的生物标志物,检测其在特定组织或细胞中的表达变化,可以为疾病的诊断、预后和预测提供依据,具有潜在的临床应用前景。目前大多数miRNA检测方法局限于体外定量检测,无法获取miRNA在相关组织和细胞中的表达信息。而原位成像不仅可以比较miRNA在不同细胞中的表达水平,还可以检测同一细胞中miRNA在时间和空间上的表达变化。因此,建立可同时应用于体外检测和细胞原位成像的miRNA检测方法,不仅能够用于疾病的筛查诊断,而且对miRNA的功能研究也具有重要的意义。本课题基于引物交换反应（Primer Exchange Reaction,PER）、脱氧核酶（DNAzyme）和催化发夹组装（Catalytic Hairpin Assembly,CHA）这三种核酸信号放大技术,建立了多种miRNA体外检测新方法,并成功用于miRNA的原位成像。1.基于核酸扩增的miRNA检测新方法利用引物交换反应可以恒温合成核酸链的特点,建立了一种新型的miRNA检测方法。该方法体系简单,检测迅速,检测范围为32 fmol～1024 fmol。后续研究中将PER反应与CHA技术结合,建立了PER-CHA法,进一步提高检测灵敏度,成功将检测下限提高至5 fmol,同时该方法抗生物基质干扰能力强,可在20%浓度的血清样本中完成对miR-200a的定量测定,具有临床检测的应用潜力。2.基于脱氧核酶的miRNA检测新方法利用金属离子依赖性脱氧核酶仅需相应金属离子辅助即可催化特定核酸底物裂解的特性,建立了一种新型的无酶miRNA检测方法。该方法操作简便,成本低廉,在37℃的恒温条件下实现对miR-146b的定量检测,检测范围为200 fmol～3200 fmol。同时,将脱氧核酶与CHA技术进行联用,建立了DNAzyme-CHA法,不仅将检测灵敏度提高至25 fmol,并成功应用于细胞样品中miR-146b的原位成像。本课题通过对原理的剖析,设计探针将引物交换反应应用于miRNA检测,并结合催化发夹组装技术提高了方法的检测灵敏度。为解决引物交换反应使用DNA聚合酶的局限,利用脱氧核酶这一具有催化能力的核酸分子开发了新型的无酶miRNA检测方法。同时,将其与无酶的催化发夹组装技术联用,提高了方法的灵敏度,成功将其用于miRNA的原位成像,为miRNA在相关细胞中空间表达研究提供了检测手段,也为miRNA检测方法的开发拓展了新的思路。
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