黄曲霉是一类常见农作物病原菌,能够产生具有剧毒和强致癌性的次级代谢产物黄曲霉毒素,污染农作物及其制品,进而影响人类健康并造成巨大的经济损失。因此,对黄曲霉形态发生和黄曲霉毒素生物合成调控机制的研究愈发重要。蛋白质的磷酸化是一种重要的可逆的蛋白质翻译后修饰,参与多种生命活动过程的调控。在寄生曲霉的研究中表明,钙调蛋白的磷酸化水平会调节黄曲霉毒素的产生。而在黄曲霉中,蛋白质的磷酸化与黄曲霉毒素生物合成的关系还未见报道。因此,本研究采用蛋白组学分析方法来研究它们的关系。首先分别提取未产毒和产毒高峰期的黄曲霉菌丝体蛋白,通过高通量LC-MS/MS鉴定,筛选到544个磷酸化肽段,包含598个高置信度的磷酸化位点,这些肽段分属于283个蛋白。从中挑选了一个感兴趣的磷酸化蛋白Ste11。该蛋白在酿酒酵母和构巢曲霉中的同源蛋白Ste11是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)路径的一种丝裂原活化蛋白激酶的激酶的激酶(MAPKKK),可以诱发中下游激酶的激酶(MAPKK)的磷酸化。为了在黄曲霉中研究Ste11的磷酸化对黄曲霉毒素生物合成的影响,构建了ste11基因的敲除株和互补株。与野生型菌株相比,ste11的敲除会影响黄曲霉的生长速率、产孢、产菌核及侵染能力,尤其是严重影响黄曲霉毒素的生物合成。为了进一步证明Ste11的功能与磷酸化修饰相关,分别构建了ste11的突变株S187A和S187D,表型分析结果显示S187A与ste11敲除株有类似的表型。这些结果表明Ste11在黄曲霉的形态发生过程和黄曲霉毒素的生物合成过程中发挥功能,Ste11第187位丝氨酸的磷酸化修饰与Ste11发挥功能密切相关。除了磷酸化修饰外,另一种重要的蛋白质翻译后修饰——琥珀酰化修饰对黄曲霉生长发育和产毒的影响也是研究的内容。不同的碳源会影响大肠杆菌蛋白的琥珀酰化修饰丰度,而碳源也会影响黄曲霉中黄曲霉毒素的产量。因此同样利用蛋白组学分析的方法来研究黄曲霉中蛋白质的琥珀酰化修饰对黄曲霉毒素生物合成的影响。总共筛选到1013个琥珀酰化肽段,包含986个高置信度的琥珀酰化位点,这些肽段分属于349个蛋白。选取其中一个蛋白AflE进行后续实验。它在寄生曲霉中的同源蛋白是黄曲霉毒素生物合成路径中的催化上游反应的一个脱氢酶。为了在黄曲霉中研究琥珀酰化修饰对黄曲霉毒素生物合成的影响,构建了aflE的敲除株和互补株,在人工合成培养基上观察表型。与野生型相比,aflE敲除株的菌核减少,黄曲霉毒素的产量下降。在花生侵染实验中,aflE敲除株侵染宿主的能力下降,产孢减少,所产生的黄曲霉毒素也大大减少。为了进一步研究AflE以上的功能是否与琥珀酰化修饰相关,构建了aflE琥珀酰化位点的基因突变株K370A和K370R,并观察表型变化。突变株形成的菌核数量和产生的黄曲霉毒素的产量都比野生型少,与alfE敲除株的表型很类似,说明AflE第370位赖氨酸的琥珀酰化修饰对AflE在黄曲霉中发挥功能有重要影响。赖氨酸的乙酰化修饰已经被证明是参与物质代谢过程的一种重要的翻译后修饰。也通过蛋白组学分析的方法来研究乙酰化修饰对黄曲霉生长发育和产毒的影响。通过高通量的质谱分析,共鉴定到1293个乙酰化肽段,包含1313个高置信度的乙酰化位点,这些肽段分属于727个乙酰化蛋白。选取AflK进行后续研究。该蛋白在寄生曲霉中的同源蛋白为黄曲霉毒素生物合成路径中的酶。通过构建aflK敲除株和互补株并比较它们与野生型菌株的表型差异,发现aflK的敲除导致了黄曲霉在人工合成培养基上的菌核形成能力下降、黄曲霉毒素的产量减少。虽然aflK敲除株侵染花生后的产孢量与野生型菌株没有明显区别,但该基因缺失株的黄曲霉毒素产量显著下降。以上结果表明AflK在黄曲霉菌核形成和黄曲霉毒素的生物合成过程中发挥重要作用。综上,研究结果表明,在黄曲霉中蛋白质的翻译后修饰参与调控黄曲霉形态发生和黄曲霉毒素生物合成过程。