【摘 要】
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囊泡运输是真核生物的一种重要的细胞学活动,广泛参与了多种生物学过程。该过程主要包括囊泡形成、转运、拴系和与目的膜融合四个环节。其中,拴系过程介导了运输囊泡与靶膜在空间上的最初接触,在时空上调控了下游膜融合事件的发生,是极性囊泡运输调控的关键环节。现已知九种多蛋白亚基拴系复合体（MULTISUBUNIT TETHERING COMPLEXES,MTCS）参与了不同途径的胞内转运过程,其中,胞泌复合体
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囊泡运输是真核生物的一种重要的细胞学活动,广泛参与了多种生物学过程。该过程主要包括囊泡形成、转运、拴系和与目的膜融合四个环节。其中,拴系过程介导了运输囊泡与靶膜在空间上的最初接触,在时空上调控了下游膜融合事件的发生,是极性囊泡运输调控的关键环节。现已知九种多蛋白亚基拴系复合体（MULTISUBUNIT TETHERING COMPLEXES,MTCS）参与了不同途径的胞内转运过程,其中,胞泌复合体（EXOCYST COMPLEX）介导了运输囊泡与质膜的拴系过程。该复合体由八个亚基组成,其中EXO70亚基与膜脂和Rho GTPase互作,是介导复合体在靶膜组装的关键亚基,一直受到研究者的高度关注。陆生植物EXO70由多个同源基因编码,实验室前期结果发现,EXO70家族的一个成员EXO70C1在成熟花粉中有较高的表达,但是发挥怎样的功能目前还不清楚。本研究利用反向遗传学的方法,通过对T-DNA插入突变体花粉管表型的观察,探究EXO70C1参与的细胞学过程;通过对EXO70C1在花粉管中的定位及动态行为的观察,初步了解EXO70C1在囊泡转运过程中的作用特点;通过酵母双杂交技术寻找EXO70C1的互作蛋白,研究结果有助于理解EXO70C1在花粉管生长过程中的功能。主要结果及结论如下:（1）exo70c1-2遗传学研究通过对exo70c1-2花粉的表型进行分析,我们发现exo70c1-2的花粉体外萌发率显著高于野生型,但是花粉管的生长速率显著低于野生型,显示EXO70C1是花粉萌发的负调控因子,而在花粉管生长过程中EXO70C1则发挥正调控作用。我们进一步对体内自交分离比及花粉传递效率进行检测,发现杂合突变体的自交分离比正常,花粉的传递效率较野生型没有显著差异,推测携带EXO70C1突变的花粉管生长的表型可被其花粉萌发的表型中和。我们构建的EXO70C1p::EXO70C1-GFP载体互补了突变体体外萌发率升高及生长速率降低的表型,说明突变体的表型是由于EXO70C1突变导致,且该融合蛋白可以替代内源EXO70C1的功能。（2）EXO70C1-GFP的细胞学观察为了研究EXO70C1细胞内的定位及行为特点,我们利用激光共聚焦显微镜对EXO70C1p::EXO70C1-GFP转基因植物花粉进行活体细胞学观察,发现EXO70C1-GFP分布于成熟花粉粒及花粉管中,在生长的花粉管顶端有GFP信号聚集。为了确认EXO70C1是否定位于质膜,我们使用全内反射荧光技术对花粉管顶端质膜进行了观察,发现EXO70C1-GFP在花粉管顶端的质膜上呈斑点状分布,信号在质膜滞留约0.1秒,推测目的蛋白参与花粉管顶端的胞吐过程。为进一步研究EXO70C1的作用特点,我们使用FM4-64染色标记花粉管内吞途径,发现EXO70C1-GFP没有与FM4-64信号共定位,表示EXO70C1可能没有在内吞途径发挥作用。（3）EXO70C1互作蛋白的筛选对EXO70C1互作蛋白的寻找有助于我们了解EXO70C1的作用机制。由于EXO70C1主要分布于细胞质,仅在质膜短暂滞留,因此我们选择了Split-ubiquitin酵母双杂交技术,利用截短的EXO70C1做诱饵,筛选花粉c DNA文库,获得一个阳性克隆,测序结果显示该克隆与源于SYP131的一个片段匹配。SYP131编码一个花粉中特异表达的tSNARE蛋白,推测EXO70C1与SYP131协同调控囊泡运输过程。（4）exo70c1-1连锁分析前期发现EXO70C1另外一个等位突变体exo70c1-1呈现花粉生长和主根生长的缺陷,进一步的细胞学表型分析,发现其花粉中存在巨大花粉及败育花粉,且突变体花粉的传递效率下降,但转基因互补构建不能恢复突变体表型;连锁分析实验证明exo70c1-1突变体的主根生长及花粉发育缺陷的表型与EXO70C1缺失不连锁,表明该表型由其他突变位点导致。
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