【摘 要】
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低温α-淀粉酶是一类重要的水解酶,其能在低温条件下发挥水解功能,在食品加工、纺织品退浆、生物燃料制造等方面展现出较大的应用潜能。但目前商业化的低温α-淀粉酶还比较少,因此为满足工业的大量需求,进行新型低温α-淀粉酶的挖掘和研究非常重要。本课题以南极海冰细菌低温α-淀粉酶高产菌株M175为研究对象,利用基因工程、定点突变及分子动力学模拟等方法对新型低温α-淀粉酶进行挖掘,探究其酶学特性,为低温α-淀
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低温α-淀粉酶是一类重要的水解酶,其能在低温条件下发挥水解功能,在食品加工、纺织品退浆、生物燃料制造等方面展现出较大的应用潜能。但目前商业化的低温α-淀粉酶还比较少,因此为满足工业的大量需求,进行新型低温α-淀粉酶的挖掘和研究非常重要。本课题以南极海冰细菌低温α-淀粉酶高产菌株M175为研究对象,利用基因工程、定点突变及分子动力学模拟等方法对新型低温α-淀粉酶进行挖掘,探究其酶学特性,为低温α-淀粉酶的工业生产奠定基础。对低温α-淀粉酶高产菌株M175进行生理生化和系统发育树鉴定,其属于Pseudoalteromonas属,命名为Pseudoalteromonas sp.M175。采用（NH4）2SO4沉淀、离子交换层析和凝胶排阻层析多个步骤对M175菌株野生型α-淀粉酶（wtAmy175）进行分离纯化,纯化后酶的比活力为289.79 U/mg。通过酶学性质研究可知wtAmy175的最适温度为30℃,在40℃以上稳定性较差,是典型的低温酶。此外,其最适pH为7.5,对SDS具有较好的耐受性。水解能力分析结果显示wtAmy175具有α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶双重活性。对M175菌株的低温α-淀粉酶基因（amy175）进行克隆和序列分析。该蛋白与其它已报道的α-淀粉酶同源性都很低,是一种新型α-淀粉酶。该蛋白中起稳定性作用的精氨酸含量较低（2.7%）,没有二硫键,而且三级结构TIM桶中的β-6和β-7被环所取代,显示了其结构上高度的柔韧性。对amy175基因进行原核表达,并对诱导表达条件进行优化,优化后破碎上清中α-淀粉酶活力可达141.1 U/m L。利用Ni亲和层析对重组α-淀粉酶（Amy175）进行纯化,质谱鉴定结果显示Amy175是与wtAmy175相对应的重组型蛋白。通过酶学性质研究可知Amy175的最适温度（25℃）低于野生型酶,最适pH为8.0,最适盐度为1 mol/L NaCl。因此,Amy175是一种耐低温耐盐的α-淀粉酶。与野生酶相似,Amy175能特异性的水解α-1,4糖苷键,同时具有α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性,属于GH13＿36亚家族。利用定点突变对Amy175进行分子改造,以提高其热稳定性。将Amy175的181位和451位甘氨酸突变为脯氨酸,结果显示突变体G181P、G451P和G181P/G451P的最适温度和最适pH没有发生变化,但热稳定性都明显提高。在40℃保温60 min,突变体的残余活性分别提高为原来的1.7、2.0和2.7倍。在313 K进行分子动力学模拟,与Amy175相比较,突变体的RMSD值、PMSF值、Rg值以及SASA值都发生了不同程度的减小,氢键数目增加,活性位点间距离缩短,双突变体最为明显,进一步证明将Amy175的181位和451位甘氨酸突变为脯氨酸能提高蛋白的热稳定性。通过分子对接对Amy175与麦芽糖及麦芽三糖的结合进行研究,结果显示静电作用力和范德华力是影响Amy175与底物结合的主要作用力。V142、R242和N370是Amy175结合麦芽糖的最重要的氨基酸,而R242、W288和H371在结合麦芽三糖中起关键作用。催化三联体D244、E286及D372是参与Amy175与底物形成氢键的主要氨基酸,这些研究有助于我们更好地理解ɑ-淀粉酶的作用机制。本文对南极海冰细菌Pseudoalteromonas sp.M175的野生型低温α-淀粉酶（wtAmy175）和重组型低温α-淀粉酶（Amy175）的酶学性质进行了详细的研究,并以提高热稳定性为目的对重组酶进行了改造,为低温α-淀粉酶的积累、深入研究和应用奠定了基础。
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