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目的:检测TIM-1在非小细胞肺癌及其癌旁组织的表达,观察其表达差异及与临床特征的相关性,推测TIM-1在NSCLC中的可能作用;以过表达或敲低NSCLC相关细胞系中TIM-1的表达,利用体内外实验研究验证TIM-1对NSCLC的作用及可能机制。方法:1.采用免疫组化方法检测83例人NSCLC组织及其癌旁组织中TIM-1蛋白表达水平,并结合临床及病理特征分析TIM-1的表达与性别、年龄、临床分期、肿瘤大小、淋巴结转移情况、远处转移情况、间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase,ALK)是否表达、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是否表达等的相关性。2.在六种不同NSCLC细胞系(A549、SK-MES-1、HCC827、H1299、PC9、H1975)通过qRT-PCR和Western blotting分别检测TIM-1的mRNA水平和蛋白质水平的表达情况。3.采用过表达TIM-1的慢病毒载体和空载阴性慢病毒载体转染表达相对较低的PC9和H1299细胞;用敲低TIM-1的慢病毒载体和空载阴性慢病毒载体转染表达相对较高的A549细胞,嘌呤霉素筛选稳定转染细胞;采用倒置荧光显微镜观察荧光表达率;采用qRT-PCR及Western blotting验证TIM-1表达效果。4.用平板克隆形成实验进行体外观察过表达、敲低TIM-1对NSCLC细胞系增殖能力的影响。5.采用Annexin V-APC/PI双染流式细胞术检测TIM-1对NSCLC细胞凋亡的影响。6.采用裸鼠皮下成瘤实验进行体内观察TIM-1对NSCLC细胞成瘤能力的影响。7.采用划痕愈合实验、Transwell迁移实验进行体外观察TIM-1对NSCLC细胞迁移能力的影响。采用Transwell侵袭实验观察TIM-1对NSCLC细胞侵袭能力的影响。8.采用Western blotting检测敲低、过表达TIM-1对NSCLC细胞周期凋亡相关分子Cyclin D1、P27、Bc1-2、Caspase-3和Bax的影响。9.采用Western blotting检测敲低、过表达TIM-1后对NSCLC细胞侵袭转移相关分子E-cadherin、N-cadherin、MMP-2、MMP-9和Vimentin的影响。10.采用Western blotting检测敲低、过表达TIM-1后对NSCLC细胞PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白PI3K、AKT、p-AKT和mTOR的影响。结果:1.免疫组化结果显示TIM-1蛋白在NSCLC组织(100%,83/83)中的阳性表达明显高于癌旁组织(20.48%,17/83),差异有统计学意义(P=0.000)。TIM-1的表达与NSCLC患者的性别、年龄、临床分期、肿瘤大小(T)、有无淋巴结转移(N)、有无远处转移(M)、间变性淋巴瘤激酶(ALK)是否阳性、表皮生长因子受体(EGFR)是否阳性差异无统计学意义(P>0.05)。2.qRT-PCR及Western blotting检测结果均显示TIM-1在NSCLC细胞系A549、SK-MES-1、HCC827、H1299、PC9和H1975中存在差异性,其中在PC9和H1299细胞中表达相对较低,A549细胞中表达相对较高。3.使用敲低(A549)、过表达(PC9、H1299)TIM-1慢病毒转染并经嘌呤霉素筛选后,在倒置荧光显微镜观察显示PC9、H1299、A549细胞稳转株的荧光转染效率均达到90%以上;qRT-PCR和Western blotting结果均显示PC9和H1299细胞中LV-TIM-1组的mRNA和蛋白质表达水平明显高于MOCK组和LV-NC组(P<0.001),而MOCK组与LV-NC组两两比较差异无统计学意义(P>0.05);A549细胞sh-TIM-1组的mRNA和蛋白质中的TIM-1表达水平明显低于MOCK组和sh-NC组(P<0.001),而MOCK组与sh-NC组两两比较差异无统计学意义(P>0.05)。4.克隆形成实验结果显示:PC9和H1299细胞LV-TIM-1组的克隆形成能力明显高于MOCK组和LV-NC组(P<0.05),而MOCK组和LV-NC组没有明显差异(P>0.05);A549细胞sh-TIM-1组的克隆形成能力明显低于MOCK组和sh-NC组(P<0.001),而MOCK组和NC组没有明显差异(P>0.05)。5.流式细胞术检测细胞凋亡能力结果显示:PC9和H1299细胞LV-TIM-1组细胞凋亡率低于MOCK组和LV-NC组且差异有统计学意义(P<0.001),而MOCK组和LV-NC组两组间差异无统计学意义(P>0.05);A549细胞sh-TIM-1组细胞凋亡率高于MOCK组和sh-NC组且差异统计学意义(P<0.001),而MOCK组和sh-NC组两组间差异无统计学意义(P>0.05)。6.皮下裸鼠成瘤实验显示:在注射肿瘤细胞第9天后,PC9细胞LV-TIM-1组的裸鼠肿瘤大小及24天后肿瘤荧光团、肿块重量均明显高于MOCK组和LV-NC组(P<0.05),而MOCK组和LV-NC组间差异无统计学意义(P>0.05)。7.划痕愈合实验结果显示:在划痕24小时和48小时后,PC9和H1299细胞LV-TIM-1组与MOCK组、LV-NC组相比划痕愈合面积更大(P<0.01),而在MOCK组和NC组之间差异无统计学意义(P>0.05);A549细胞sh-TIM-1组划痕愈合面积与MOCK组和sh-NC组相比则较小(P<0.001),而在MOCK组和sh-NC组之间差异无统计学意义(P>0.05)。8.Transwell细胞迁移实验结果显示:PC9和H1299细胞LV-TIM-1组每高倍镜视野(×200)穿透膜的细胞数明显多于MOCK组和LV-NC,差异有统计学意义(P<0.001),而在MOCK组和LV-NC组之间无差异(P>0.05);A549细胞sh-TIM-1组每高倍视野(×200)穿透膜的细胞数明显少于MOCK组和sh-NC组,差异有统计学意义(P<0.01),而在MOCK组和sh-NC组之间无明显差异(P>0.05)。Transwell细胞侵袭实验结果显示:PC9和H1299细胞LV-TIM-1组每高倍镜视野(×400)穿过膜的细胞数明显多于MOCK组和LV-NC组,差异有统计学意义(P<0.05),而在MOCK组和LV-NC组之间差异无统计学意义(P>0.05)。A549细胞sh-TIM-1组每高倍视野(×400)穿过膜的细胞数明显少于MOCK组和sh-NC组,差异有统计学意义(P<0.001),而在MOCK组和sh-NC组之间差异无统计学意义(P>0.05)。9.Western blotting结果显示:PC9和H1299细胞过表达TIM-1均能够显著上调Cyclin D1和Bc1-2蛋白表达水平,同时下调p27、Caspaes-3蛋白表达水平,差异有统计学意义(P<0.05),过表达TIM-1显著上调PC9细胞的Bax表达水平(P<0.05),对H1299细胞Bax水平影响不大(P>0.05);A549敲低TIM-1能够显著下调Cyclin D1和Bc1-2蛋白表达水平,同时上调p27、Caspaes-3和Bax蛋白表达水平。10.Western blotting结果显示,过表达TIM-1能够显著上调PC9和H1299细胞中N-cadherin、MMP-2、MMP-9和Vimentin蛋白表达水平,同时下调E-cadherin表达水平,差异有统计学意义(P<0.05);A549敲低TIM-1能够显著下调N-cadherin、MMP-2、MMP-9和Vimentin蛋白表达水平,同时上调E-cadherin表达水平,差异有统计学意义(P<0.05),而在MOCK组和LV-NC/sh-NC组之间差异无统计学意义(P>0.05)。10.Western blotting检测结果显示在PC9和H1299细胞中过表达TIM-1能够显著上调PI3K、p-AKT和mTOR蛋白表达水平,差异有统计学意义(P<0.05),但对总AKT的表达无明显影响,差异无统计学意义(P>0.05);A549敲低TIM-1能够显著下调PI3K、p-AKT和mTOR蛋白表达水平,差异有统计学意义(P<0.05),但对总AKT的表达无明显影响,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:1.TIM-1在人NSCLC组织及其癌旁组织比较中,癌组织呈高表达;TIM-1在细胞系A549、SK-MES-1、HCC827、H1299、PC9和H1975中的表达存在差异性。2.PC9和H1299细胞过表达TIM-1下调p27、Bax和E-cadherin的表达,上调Cyclin D1、Bc1-2、N-cadherin、MMP-2、MMP-9和Vimentin蛋白表达,而H1299细胞过表达TIM-1对Bax蛋白影响不大;PI3K、p-AKT和mTOR蛋白水平也升高,而AKT总蛋白水平保持不变,而敲低TIM-1的A549细胞与过表达组结果相反。TIM-1可以通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路调节细胞增殖、迁移和侵袭能力,诱导EMT转变,参与NSCLC的发生发展。3.TIM-1可能为诊断和治疗提供新的靶点。