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结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是世界范围内发病率第三、死亡率第二的恶性肿瘤,每年新增的CRC患者超过193万人。由于其早期阶段的症状不明显,发现时多为Ⅲ期,甚至Ⅳ期。转移性CRC面临着难以根治以及预后不良等问题。因此,寻找CRC发生及发展的关键标志物具有重要意义。本研究发现尿路上皮素1A（uroplakinsla,UPK1A）具有潜在的临床价值。既往研究发现UPK1A可影响膀胱癌、肺癌、肝癌等多种恶性肿瘤的发生和发展。然而,UPK1A在CRC中的作用和对患者生存的影响尚不完全清楚。本研究旨在探讨UPK1A在CRC中的表达和作用。首先,本研究第一部分通过癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库发现UPK1A在CRC中的表达显著上调,并且通过生物信息学工具和在线数据库预测了 UPK1A可能促进肿瘤细胞的增殖。本研究的第二部分在CRC细胞系上证明了 UPK1A在CRC中表达上调,并且发现UPK1A的表达被敲低后CRC细胞的增殖受到抑制。然后,本研究在88对CRC组织和癌旁组织上再次验证了 UPK1A的表达。最后,本研究结合与CRC组织来源对应的患者临床信息,通过Kaplan-Meier方法分析发现UPK1A高表达是影响CRC患者生存的不利因素。多因素Cox回归分析显示UPK1A高表达是CRC患者生存率不良的独立危险因素之一。综合以上结果,UPK1A可能在CRC的发生和发展中有重要作用,有望成为早期鉴别CRC的诊断标志物和评估CRC患者生存的预测标志物。第一部分 生物信息学方法筛选影响结直肠癌发生发展的关键分子:UPK1A方法:1、数据提取与差异基因的初筛:从TCGA数据库提取CRC数据集,初步筛选出CRC组织表达显著上调的基因,分析这些基因的功能与作用通路。2、利用病理参数和算法进一步筛选:根据不同病理参数和Estimate算法免疫评分分组的差异,进一步筛选出与CRC患者生存相关的目的分子集。3、目的基因的确定及功能预测:通过在线数据库,逐一分析目的分子集中各个基因不同表达量分组患者的OS、DFS,从而选定对CRC患者预后不良相关性最强的基因。最后,通过GSEA分析目的基因可能存在的作用通路,以预测目的基因在CRC发生发展中的作用。结果:1.TCGA数据库的612例结直肠癌样本,呈现28750个基因的表达量数据,设置LogFC＞1,P＜0.05,相对正常结直肠组织基因表达,5091个基因表达上调。这些差异基因的功能主要表现炎症、免疫、细胞迁移和细胞信号传导等方面。2.Ⅳ期CRC患者的生存率则比其他分期患者差,P＜0.05。Ⅳ期CRC患者的肿瘤微环境免疫评分显著低于其他分期患者P＜0.05。其中136个基因在Ⅳ期CRC中的表达上调显著。本研究推测136个基因中可能存在加速CRC进展的重要分子,可作为本研究的目的分子集。3.目的分子集中仅UPK1A高表达组患者的DFS和OS均劣与UPK1A低表达组患者,P＜0.05。GSEA分析提示UPKIA作用于细胞营养代谢、DNA合成等相关通路。小结:TCGA数据显示UPK1A在CRC组织中显著高表达,并且可能与CRC患者生存率不良相关。UPK1A可能与CRC肿瘤细胞增殖相关。UPK1A具有预测CRC发生、发展及患者预后的潜在价值。第二部分 UPK1A在结直肠癌中的表达验证及功能研究方法:1.验证CRC和正常结直肠组织中UPK1A的表达差异通过免疫组织化学技术测定88例CRC组织和癌旁组织中UPK1A的染色强度与染色阳性率。计算表达评分,通过Graph Pad Prism 8分析高表达组与低表达组的评分差异。此外,通过蛋白免疫印记试验（western blotting,WB）,实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR）验证UPK1A在CRC细胞系SW480、HCT116与人正常结直肠粘膜细胞系FHC中的表达差异。2.探索UPK1A在CRC发生发展中的功能通过RNA干扰技术敲低UPK1A在CRC细胞系HCT116中的表达量,通过CCK-8实验分析两个敲低组和NC组细胞增殖情况,通过qPCR和WB测定敲低组和NC组细胞增殖相关分子（Ki-67、MCM3、PCNA）的表达情况。3.探索UPK1A的表达量与CRC患者信息和病理参数的关系根据免疫组织化学分析结果,分析不同患者信息和病理参数分组的UPK1A的表达情况。采用Kaplan-Meier方法分析不同UPK1A表达量、临床信息、病理参数分组的生存差异。采用Cox回归分析筛选影响CRC患者预后的关键因素。结果:1.分析88对CRC组织和癌旁组织的UPK1A表达量,CRC组织中有60例高表达,28例低表达。结直肠正常癌旁组织中23例高表达,65例低表达。CRC组织中UPK1A的表达量显著高于正常癌旁组织,P＜0.05。2.在R1NA水平和蛋白水平,UPK1A在CRC细胞系SW480、HCT116中的表达均高于人正常结直肠粘膜细胞系FHC,差异具有统计学意义,P＜0.05。3.通过RNA干扰实验、CCK-8实验,UPK1A表达下调后,在8h、24 h和48 h 3个时间节点上两敲低组si-1、si-2的OD值均低于NC组,其差异有统计学意义,P＜0.05。4.UPK1A表达下调后,在RNA和蛋白水平,两敲低组si-1、si-2的Ki-67和MCM3的表达均低于NC组,其差异有统计学意义,P＜0.05。UPK1A表达下调后,在RNA和蛋白水平,两敲低组si-1、si-2的PCNA的表达均低于NC组,表达差异较小。5.生存分析显示UPK1A高表达、高T分期（T3、T4）是影响CRC患者生存的不利因素,P＜0.05。6.多因素Cox回归分析显示UPK1A高表达是CRC患者生存率不良的独立危险因素。小结:UPK1A在CRC中显著高表达,其表达下调抑制了 CRC细胞的增殖能力。UPK1A的表达量与CRC患者预后相关,UPK1A高表达的CRC患者生存期显著降低。结论:1.UPK1A可以作为区分结直肠癌组织和正常结直肠组织的诊断标记物。2.UPK1A的表达可能在结直肠癌的进展中有重要作用。3.UPK1A的高表达是影响结直肠癌患者预后的独立危险因素之一。