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乳酸菌被认为是一类有促进宿主机体健康作用的益生菌,对人类和动物疾病的治疗非常有效。乳酸菌作为一类微生物制剂已广泛应用于畜禽养殖领域,它们也被认为是改善动物健康,替代抗生素的最佳产品。鉴于乳酸菌作为肠道自然微生物群的一部分,并参与改善体内肠道健康稳态及平衡具有重要作用,因此研究其作为微生物分泌代谢产物发挥免疫调节作用机制,及作为基因工程宿主传递活菌载体系统具有重要的作用,并具有其独特的天然优势。本研究拟利用CRISPR-Cas9基因编辑系统敲除基因组PyrR基因,构建PyrR基因缺失乳酸杆菌;利用此系统在乳酸菌基因组插入猪IFN-λ基因,构建基因组表达IFN-λ的乳酸杆菌,实现乳酸菌基因组高效、稳定表达外源蛋白的能力;另外,动物口服基因编辑外源表达IFN-λ的乳酸杆菌,探讨乳酸杆菌外源表达猪IFN-λ对动物机体免疫调节的作用。主要研究成果如下:1.构建获得基因组表达猪IFN-λ基因的干酪乳杆菌以干酪乳杆菌为亲本株进行基因编辑,基于CRIPSR-Cas9技术构建基因编辑质粒。首先扩增IFN-λ和PLDH启动子,利用融合PCR技术获得PLDH-IFN-λ基因,并在其两段分别利用融合PCR技术,融合1326基因的左右同源臂（HAS1326.1和HAS1326.2）,获得插入基因片段命名为HAS1326.1-PLDH-IFN-λ-HAS1326.2,并把该片段连接于T载体进行基因克隆。基因合成含有Sg RNA序列和同源臂前导序列的引物,PCR扩增HAS1326.1-PLDH-IFN-λ-HAS1326.2,使其Sg RNA序列融合至同源臂HAS1326.1基因前端,把该基因克隆至T载体上,命名为p MD19-Sg RNA-HAS1326.1-PLDH-IFN-λ-HAS1326.2。利用双酶切连接方法把Sg RNA-HAS1326.1-PLDH-IFN-λ-HAS1326.2基因连接于含有Cas9基因的基因编辑质粒p LCNICK上,获得p LCNICK-Lc2W-IFN-λ基因编辑质粒。构建获得的基因编辑质粒pLCNICK-Lc2W-IFN-λ电转化至干酪乳杆菌,Cas9蛋白在基因组的1326基因位点进行基因切割编辑,使含有左右同源臂的HAS-IFN-λ基因插入基因组。提取基因编辑干酪乳杆菌基因组,进行基因组IFN-λ基因及其同源臂的扩增,结果显示获得符合预期大小的约2800 bp的1326+IFN-λ片段;经序列测定符合IFN-λ基因及其同源臂的插入特征。Western Blot结果表明,与对照菌干酪乳杆菌相比,重组菌Lc2W/IFN-λ于21 k Da左右出现目的蛋白,条带与预期大小相符。上述研究证实,通过基因编辑技术在特定位点实现基因编辑,IFN-λ基因插入至干酪乳杆菌基因组1326基因的左右同源臂两端,实现IFN-λ基因在干酪乳杆菌基因组上的外源表达。2.构建获得基因组缺失PyrR基因的干酪乳杆菌以干酪乳杆菌为亲本株进行基因编辑,基于CRIPSR-Cas9技术构建基因编辑缺失PyrR基因质粒。首先PCR扩增干酪乳杆菌基因组的PyrR基因及其左右同源臂基因,扩增的目的基因片段大小约为2600bp。然后分别扩增PyrR基因左右同源臂,目的片段大小为1000bp,分别命名为PyrRHAS-up和PyrRHAS-down。利用融合PCR技术扩增连接上述两个同源臂片段,目的片段大小为2000bp,命名为PyrRHAS-up+PyrRHAS-down。基因合成含有Sg RNA序列和同源臂前导序列的引物,PCR扩增PyrRHAS-up+PyrRHAS-down,使其Sg RNA序列融合至同源臂PyrRHAS-up基因前端,把该基因克隆至T载体上,命名为p MD19-Sg RNA-PyrRHAS-up+PyrRHAS-down。利用双酶切连接方法把Sg RNAPyrRHAS-up+PyrRHAS-down基因连接于含有Cas9基因的基因编辑质粒pLCNICK上,获得pLCNICK-PyrR基因编辑质粒。构建获得的基因编辑质粒pLCNICK-PyrR电转化至干酪乳杆菌,Cas9蛋白在基因组的PyrR基因位点进行基因切割编辑,使缺失PyrR基因的左右同源臂插入到干酪乳杆菌基因组中。提取基因编辑干酪乳杆菌基因组,进行基因组PyrR基因同源臂的扩增,结果显示获得符合预期大小的约2200 bp的PyrR基因左右同源臂片段;经序列测定,符合PyrR基因左右同源臂的特征。Western Blot结果表明,与重组菌相比,对照组干酪乳杆菌于20 k Da左右出现目的蛋白,条带与预期大小相符。上述研究证实,实现通过基因编辑技术在特定位点实现基因编辑,干酪乳杆菌的PyrR基因在基因组上的缺失表达。3.基因组表达IFN-λ的干酪乳杆菌对新生仔猪肠黏膜免疫的调节口服表达IFN-λ的干酪乳杆菌结果可知,口服IFN-λ插入型乳酸杆菌有助于提高哺乳仔猪日增重,同为塞内卡病毒感染组,口服IFN-λ插入型乳酸杆菌可以显著缓解病毒感染引起的体重降低。病理实验结果表明,口服表达IFN-λ的干酪乳杆菌可以显著保护SVV感染引起的肠道上皮细胞损伤。Western Blot和q RT-PCR实验结果表明,外源表达的IFN-λ可以激活肠道特异性IFN-λ表达,同时可以激活肠黏膜免疫系统和系统免疫系统中干扰素家族各型干扰素的表达。IFN-λ主要通过激活肠上皮细胞中细胞核转录因子STAT3的表达,而不是激活AKT细胞信号通路激活IFN-λ家族细胞因子的转录。同时,WNT和IGF蛋白表达结果表明,IFN-λ可以诱导肠道上皮细胞中肠干细胞信号分子的表达,在SVV感染后诱导干细胞增殖分化,促进病毒感染后肠道细胞的修复。抗体亚类结果显示,口服表达IFN-λ的干酪乳杆菌对体液免疫和黏膜免疫具有调节作用,可以增加机体IgA、IgG和IGM抗体的含量,并对病毒感染具有保护作用。这说明运用CRISPR/Cas9基因编辑技术编辑的插入IFN-λ基因,乳酸菌成功表达猪IFN-λ,在复杂的微生物生态系统发挥抗病毒感染的作用,提高哺乳仔猪机体的抗感染免疫能力。