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中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis),俗称河蟹、大闸蟹,是一种高价值的经济水产品,在我国淡水养殖业中所占的比重较大。随着集约型养殖业的发展,细菌、病毒以及寄生虫等病原体引发的疾病越来越多,给水产养殖业带来严重的打击。中华绒螯蟹螺原体(Spiroplasma eriocheiris)是近年来侵染中华绒螯蟹、克氏原螯虾(Procambarus clarkii)、南美白对虾(Litopenaeus vannamei)、罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)以及日本沼虾(Macrobrachium nipponensis)等水生甲壳动物的重要病原。螺原体首先感染中华绒螯蟹的血淋巴细胞,然后通过血液循环扩散到全身,进而侵染肌肉和神经等组织,导致中华绒螯蟹附肢颤抖直至死亡,因而该病被称为中华绒螯蟹“颤抖病”。中华绒螯蟹仅有先天性免疫,其中黑化反应是最有效的免疫方式之一,由丝氨酸蛋白酶激活的酚氧化酶系统是黑化反应中的重要成分。为研究中华绒螯蟹的三种丝氨酸蛋白酶(EsTLSP-Ⅰ、EsTLSP-Ⅱ和EsShK-SP)及EsShK-SP中两种ShK结构域(EsShK1和EsShK2)在中华绒螯蟹感染螺原体过程中的功能研究。本论文主要利用了生物信息学分析、双链RNA干扰技术、原核表达以及真核表达等技术展开了研究,主要得到了以下三个结果:1.EsTLSP-Ⅰ和EsTLSP-Ⅱ在螺原体侵染中华绒螯蟹过程的功能研究胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶(TLSPs)是丝氨酸蛋白酶家族中的成员,在免疫应答上起到重要的作用。本论文研究中华绒螯蟹两种TLSPs,EsTLSP-Ⅰ和EsTLSPII在螺原体侵染过程中的作用。进化树分析表明,EsTLSP-Ⅰ和EsTLSP-Ⅱ属于两个不同的类群,每个类群内的甲壳动物都是特定的。组织分布分析发现,EsTLSPI和EsTLSP-Ⅱ在血淋巴细胞、鳃和肠中的表达量比较高。当中华绒螯蟹感染螺原体后,EsTLSP-Ⅰ和EsTLSP-Ⅱ的表达量显著上调。利用双链RNA将EsTLSP-Ⅰ和EsTLSP-Ⅱ分别干扰后,发现下游基因proPO和血淋巴细胞的PO活性明显下调,同时螺原体侵染中华绒螯蟹后,血淋巴细胞中的螺原体拷贝数和中华绒螯蟹的死亡率均明显升高。EsTLSP-Ⅰ和EsTLSP-Ⅱ分别连接pET28a载体后进行原核表达,分别得到重组蛋白rEsTLSP-Ⅰ和rEsTLSP-Ⅱ。不同浓度的rEsTLSP-Ⅰ和rEsTLSP-Ⅱ分别刺激中华绒螯蟹血淋巴细胞,当浓度达到20μg/ml后,血淋巴细胞的PO活性与对照组相比明显上调。相同量的螺原体和不同浓度的rEsTLSP-Ⅰ和rEsTLSP-Ⅱ和刺激血淋巴细胞,当重组蛋白浓度达到2μg/ml后,血淋巴细胞的PO活性比对照组高。以上结果说明EsTLSP-Ⅰ和EsTLSP-Ⅱ在螺原体侵染中华绒螯蟹免疫过程中起到了正调控作用。2.EsShK-SP在螺原体侵染中华绒螯蟹过程的功能研究EsShK-SP全长为1927 bp,其中包括1260 bp的开放阅读框(ORF),105 bp的5’-非编码区(UTR)和562 bp的3’-UTR。该基因中含有三个结构域,分别是ShK1结构域(39个氨基酸)、ShK2结构域(27个氨基酸)和Tryp-SPC结构域(235个氨基酸)。该基因在中华绒螯蟹的血淋巴细胞、肠、鳃和神经组织中表达量较高,EsShKSP在螺原体侵染中华绒螯蟹1 d后的表达量明显上调。利用双链RNA干扰该基因后,下游基因proPO的表达量与血淋巴细胞中的PO活性明显下调,同时螺原体侵染中华绒螯蟹后,血淋巴细胞中的螺原体拷贝数和中华绒螯蟹的死亡率均明显升高。Tryp-SPC结构域和pGEX-4T-1载体连接进行原核表达,得到重组蛋白rSPC。利用不同浓度rSPC刺激中华绒螯蟹的血淋巴细胞,发现当rSPC达到100μg/ml时,血淋巴细胞的PO活性明显上调。rSPC和螺原体同时刺激血淋巴细胞时,当rSPC浓度达到2μg/ml时,血淋巴细胞的PO活性明显上调。EsShK-SP连接pAc5.1-GFP质粒转染到S2细胞中过表达后,细胞的PO活性以及细胞活性明显上调,螺原体的拷贝数比对照组明显下调。以上实验结果说明EsShK-SP在螺原体感染中华绒螯蟹过程中起到了正调控作用。3.EsShK1和EsShK2在螺原体侵染中华绒螯蟹过程的功能研究EsShK1和EsShK2分别是EsShK-SP的两个结构域,将两个结构域连接到pGEX-4T-1载体上,进行原核表达,得到重组蛋白rShK1和rShK2。不同浓度的rShK1和rShK2刺激中华绒螯蟹血淋巴细胞,发现当rShK1达到20μg/ml后,血淋巴细胞的PO活性明显上调,而rShK2达到100μg/ml后,血淋巴细胞的PO活性显著上调。在重组蛋白刺激后,用螺原体刺激血淋巴细胞发现,在两种重组蛋白达到20μg/ml后,血淋巴细胞的PO活性明显上调。接着将EsShK1和EsShK2连接到pAc5.1-GFP载体上,转染到S2细胞中,利用激光共聚焦和Western Blotting技术验证了两个结构域在S2细胞中成功表达,过表达细胞的PO活性和细胞活性均明显增高。在过表达EsShK1-GFP和EsShK2-GFP的S2细胞中,利用螺原体进行刺激,激光共聚焦和RT-PCR技术发现细胞中S2的拷贝数比对照组明显降低。以上实验说明EsShK1和EsShK2在螺原体侵染中华绒螯蟹过程中起到了正调控作用。