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近年来由各种原因导致的癌症尤其是肺癌病例逐渐增多,目前放射治疗是肺癌最重要的治疗手段,但有证据表明约16%的患者仍因局部复发导致治疗失败[1]。因此放疗抵抗引起的治疗失败成为肺癌疗效提升的瓶颈。研究表明,放射治疗主要由辐射直接或间接诱导细胞应激导致癌细胞死亡,但一小部分癌细胞可能由于细胞内损伤修复信号激活而存活,经历放射治疗后存活的癌细胞表现出放射抗性,并且能够促进肿瘤复发[2-3]。因此,深入了解有关肺癌放疗抵抗的分子机制,并以此为切入点寻找放疗增敏的潜在靶点是目前亟待解决的难点。随着长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)的发现,我们认识到lncRNA是一类长度大于200nt的非编码转录本,在多种癌症类型中异常表达,以多种方式从转录和翻译水平直接或间接参与靶基因的调控[4]。既往研究已证实lncRNA KCNQ1OT1在肺癌、结直肠癌、乳腺癌、卵巢癌中高表达,并且验证了其与肿瘤的治疗抵抗及不良预后密切相关[5]。自噬是细胞内高度保守的代谢循环过程,已有研究证实癌细胞中的保护性自噬可通过分解回收受辐射损伤的细胞器,限制放射治疗对癌细胞的杀伤效果,在肿瘤的放疗抵抗及复发中发挥重要作用[6]。因此深入了解lncRNAKCNQ1OT1及自噬在肺癌放疗抵抗中的相关机制有望为肺癌临床治疗中的放疗增敏提供新的思路。基于上述研究背景,我们拟开展如下研究以进一步探索。[目的]分析lncRNA KCNQ1OT1及自噬与肺癌细胞辐射抵抗作用的关系及机制,筛选KCNQ10T1调控的下游因子[方法](一)对肺癌A549细胞进行传代培养,利用放射疗法对A549细胞进行筛选,分离培养获得放疗抵抗的A549细胞,命名为A549/IR,通过克隆形成实验评估A549/IR细胞的放疗敏感性;通过qPCR检测A549/IR细胞及亲本A549细胞中lncRNA KCNQ1OT1的表达水平;荧光原位杂交实验定位lncRNA KCNQ1OT1 在 A549/IR 中的表达。(二)通过shRNA技术干扰前期实验获得的A549/IR细胞中lncRNA KCNQ1OT1的表达,设置对照组(A549/IR-NC),KCNQ1OT1表达下调组(A549/IR-KCNQ1OT1-shRNA),通过体外及裸鼠皮下成瘤实验检测下调KCNQ1OT1表达对A549IR细胞放疗敏感性的影响,分析lncRNA KCNQ1OT1表达与肺癌A549/IR细胞放疗抵抗之间的关系;通过Western Blotting检测KCNQ1OT1下调对自噬相关蛋白LC3B、p62表达的影响;通过透射电镜观察KCNQ1OT1下调后细胞中自噬小体数量的变化,分析KCNQ1OT1介导的放疗敏感性与细胞自噬水平之间的关系。(三)通过第二代测序技术检测下调A549/IR细胞中lncRNAKCNQ1OT1表达后,较对照组A549/IR细胞中miRNA表达谱的变化,分析差异表达的miRNA在放疗敏感性调控中可能参与的信号通路及生物功能,筛选可能参与调控的miRNA靶标,预测lncRNA KCNQ1OT1介导肺癌细胞放疗敏感性可能的下游分子机制。[结果](一)对体外培养的亲本肺癌A549细胞给予15Gy大剂量放疗照射后仍有部分肿瘤细胞存活并显示出放疗抵抗性,提示经照射筛选得到的A549/IR细胞可作为放疗抵抗模型进行后续实验研究;qPCR检测结果显示放疗抵抗的A549/IR细胞中lncRNAKCNQ1OT1表达量较对照组明显上调;克隆形成实验结果显示,经照射后存活的A549/IR细胞比亲本A549细胞系具备更强的克隆形成能力(P<0.05);FISH实验结果显示A549/IR细胞中lncRNAKCNQ1OT1定位于胞质。(二)通过慢病毒稳转A549/IR细胞后,构建对照组(A549/IR-NC)及KCNQ1OT1 表达下调组(A549/IR-KCNQ1OT1-shRNA)细胞,qPCR检测结果显示A549/IR细胞中KCNQ1OT1被明显下调。克隆形成实验结果显示下调KCNQ1OT1表达后,A549/IR细胞的增殖成瘤能力降低,放射敏感性增高;进一步Western Blotting实验结果显示,A549/IR-KCNQ1OT1-shRNA组细胞内自噬相关蛋白 LC3B 表达较 A549/IR-NC 组降低,A549/IR-KCNQ1OT1-shRNA 组 p62表达水平较A549/IR-NC组升高;透射电镜结果显示经照射后A549/IR-KCNQ1OT1-shRNA组细胞内自噬小体数量少于A549/IR-NC组;裸鼠皮下成瘤实验中,与A549/IR-NC组相比,A549/IR-KCNQ1OT1-shRNA组细胞成瘤能力及增殖能力显著下降,对放疗敏感性增高(P<0.05)。以上结果表明KCNQ1OT1表达与A549/IR细胞自噬水平呈正相关。(三)miRNA 测序结果显示 A549/IR-KCNQ1OT1-shRNA 组与 A549/IR-NC组相比,以1.5倍差异为阈值,发现347个差异表达miRNA,其中上调分子157个,下调分子190个,KEGG Pathway富集分析结果显示差异表达的miRNAs主要参与自噬调节,肿瘤内信号传递,非小细胞肺癌等相关信号通路。[结论]1.经过大剂量放疗照射亲本A549后可以分离获得具有放疗抵抗性的A549/IR细胞,这部分细胞增殖能力强于普通A549细胞。2.A549/IR细胞中lncRNA KCNQ1OT1表达较亲本A549细胞增高,表明KCNQ1OT1可能介导A549/IR细胞对放疗的敏感性。3.下调A549/IR细胞中lncRNA KCNQ1OT1的表达,可以抑制A549/IR细胞中保护性自噬水平以及增殖能力,增强放疗诱导的细胞死亡作用,提高放疗敏感性,表明lncRNA KCNQ1OT1是A549/IR放疗抵抗调节过程中的关键因子,且与自噬水平呈正相关介导A549/IR细胞的放疗敏感性。4.lncRNA KCNQ1OT1定位于A549/IR细胞的胞质,可能发挥miRNA分子海绵作用竞争性抑制miRNA的作用,从而发挥对mRNA表达的调控作用。下调lncRNAKCNQ1OT1后A549/IR细胞中差异表达的miRNA谱,尤其是差异倍数明显的miRNA可能是参与lncRNA KCNQ1OT1通过自噬水平介导肺癌A549/IR细胞放疗抵抗过程中的关键分子。本研究从lncRNA介导细胞内自噬调控的角度探讨肺癌细胞放疗抵抗可能的分子机制,上述研究结果证实了 lncRNAKCNQ1OT1是肺癌放疗抵抗的重要调节因子,A549/IR内高表达的KCNQ1OT1通过增强细胞内自噬水平实现其对放疗的抵抗性,并通过miRNA测序技术初步筛选出可能参与调控的相关miRNA,为我们后期进一步明确KCNQ1OT1介导放疗抵抗的确切分子机制提供了可能的靶点,上述研究结果为以lncRNAKCNQ1OT1为切入点提高肺癌细胞放疗的敏感性提供了部分新的线索。