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牙鲆(Paralichthys olivaceus)是典型的变态鱼类。变态期间,右眼迁移至鱼体左侧并且生活习性由浮游性转变为底栖性生活,导致其感光系统发生改变已适应生态变化。甲状腺激素(thyroid hormone,TH)在牙鲆变态过程中具有关键的调控作用,通过甲状腺素受体(thyroid hormone receptor,TR)诱导加快仔鱼的变态。此外,MicroRNA(miRNAs)也是其变态中的重要调控因子,并且受到甲状腺激素的调控,其中miR-124/96/182/183是脊椎动物视网膜发育过程中的关键调控因子。牙鲆视蛋白(Opsin)基因主要包括Rhodopsin、Red opsin、Green opsin、Blue opsin和UV opsin,是一类含有350个氨基酸残基的跨膜蛋白,主要功能是与生色团构成视色素,调节鱼类对外界光环境的适应,是生物体接受外部信息的重要途径。为了探讨在牙鲆变态期间TH、miRNAs、opsin三者如何调控牙鲆仔鱼感光系统的发育,本研究首先通过荧光RT-PCR技术检测牙鲆视蛋白基因在仔鱼早期发育的表达水平,初步筛选受TH调控的视蛋白基因;然后通过生物信息学方法预测该视蛋白启动子调控区的作用元件以及TRE结合位点,构建报告基因载体与TRαA表达载体共转染293T细胞,验证其是否受TRαA的调控;最后通过miRNAs靶基因验证实验验证miRNAs对该视蛋白的转录后调控水平,初步揭示TH、opsin、miRNAs三者在牙鲆感光系统发育中的相互作用关系,更为牙鲆变态发育机制的研究提供了新的理论支撑。1.视蛋白基因在牙鲆早期变态发育中表达差异的分析本实验中以牙鲆为实验材料,通过荧光RT-PCR检测了牙鲆视蛋白基因在成鱼各组织、变态发育各时期的表达情况以及甲状腺激素和硫脲对其表达水平的影响。结果显示:牙鲆视蛋白基因在成鱼各组织中均有不同程度的表达,但均在眼睛组织中特异性高表达。五个视蛋白基因在变态发育期间呈现出不同的表达模式,Rhodopsin、Red opsin和UV opsin的表达量从17dph开始逐渐升高并在28dph到达峰值,变态后期逐渐下降;Green opsin表达量则在变态前期24dph时最高,随着变态的进行表达量逐渐下降;而Blue opsin表达量从17dph逐渐升高直到变态后期32dph达到最高值,随后逐渐下降且41dph变态结束表达量仍显著高于变态初期。TH、TU处理变态期仔鱼的结果显示:在TH、TU的作用下,Rhodopsin、Green opsin和UV opsin均受到不同程度无规律的上调或抑制,但外源性TH对Red opsin、Blue ospin的调控明显,具有显著的正向调控作用,而TU则对Red、Blue opsin具有明显的抑制作用;通过拯救实验进一步验证TH对Red opsin、Blue ospin的调控作用,结果显示TU组仔鱼完成变态后Red opsin表达量降低,Blue opsin表达量升高,表明TH可以调控Red opsin和Blue opsin的表达。2.TRαA受体对Red opsin和Blue opsin视蛋白调控关系的验证本实验中通过生物信息学方法预测Red opsin和Blue opsin的启动子调控区的元件以及转录因子TR的结合位点-甲状腺激素应答元件(TRE),通过PCR扩增的方法克隆视蛋白基因的启动子调控区序列,分别连接到无启动子的pGL3-basic载体中构建pGL3-basic-Red opsin和pGL3-basic-Blue opsin重组质粒,与内参质粒pRL-TK,p3×flag-TRαA表达载体共转染293T细胞,检测其荧光素酶活性。结果显示:只转染重组质粒和内参质粒的荧光素酶活性均高于空载体转染组,表明均具启动子活性。pGL3-basic-Red opsin、pGL3-basic-Blue opsin和过表达载体p3×flag-TRαA共转染组的荧光素酶活性分别是对照组的1.25倍和1.95倍。为进一步验证在T3刺激作用下,TRαA是否可以促进Red opsin和Blue opsin的转录,在转染239T的过程中外源性添加终浓度为75nM的T3溶液并设置实验对照组。结果显示:在T3的刺激作用下,pGL3-basic-Red opsin、pGL3-basic-Blue opsin分别和过表达载体p3×flag-TRαA共转染组的荧光素酶活性均显著生高;并且与未加T3组相比,活性分别增加0.4倍、2倍。表明Red opsin、Blue opsin受TRαA的调控,但对Blue opsin的调控作用更强,其可能通过T3-TRαA-Blue opsin的甲状腺激素调控通路进行的。3.miR-124/96/183/182的靶基因预测与验证本实验中通过靶基因验证的方法验证miRNAs对感光系统相关基因转录后水平的调控。首先利用靶基因在线预测网站预测miR-124/96/183/182的靶基因,并筛选出与感光系统发育相关的基因Red opsin、Blue opsin、Otx2,克隆这三个基因的3’UTR区序列,连接到pmir-GLO载体中构建重组质粒,转染293T细胞系检测荧光素酶活性,结果显示,pol-miR-124能够靶向负调控Blue opsin、Otx2基因的表达,pol-miR-182则靶向负调控Blue opsin基因。表明pol-miR-124/182可以对Blue opsin、Otx2进行转录后调控。总之,本研究分析了五个视蛋白在牙鲆各组织和发育时期的表达谱,以及外源甲状腺激素对视蛋白在牙鲆变态时期的影响;进一步通过启动子报告基因实验验证了在T3的作用下,Red opsin、Blue opsin受TRαA的调控;最后通过靶基因验证实验了pol-miR-124的靶基因Blue opsin、Otx2,pol-miR-182的靶基因Blue opsin,初步探讨了TH、opsin以及miRNAs三者在牙鲆感光系统发育中的相互作用关系,为牙鲆变态发育机制的提供新的基础性资料。