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结核病(Tuberculosis,TB)是一种由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的传染性很强的流行性疾病,严重危害人类健康。现有的结核病临床诊断方法,如痰涂片镜检、细菌培养、X射线检查等,或因灵敏度低、或因耗时长、或因仪器昂贵而无法在结核病的早期诊断中得到应用。近年来,相关科研工作者积极开发基于核酸扩增技术(Nucleic Acid Amplification Technology,NAAT)的结核病快速诊断方法。这些方法检测速度快且灵敏度高,但需借助酶以及专业的技术人员和精密的实验设备来实现从而限制了NAAT在临床的应用。基于此,本文开发了两种新型的快速、简易、低成本的结核病诊断方法。该方法无需酶参与即可实现结核分枝杆菌特定基因序列的检测,具体内容如下:(1)构建基于链置换反应(Strand displacement amplification,SDA)和磁珠(Magnetic beads,MBs)的结核分枝杆菌检测方法。本文设计的用于MTB 16sDNA检测的SDA包括两个DNA发夹探针,分别为MBs修饰的识别探针(MBs-Hp1)和TAMRA修饰的信号探针(TAMRA-Hp2)。无靶物时,两个探针均为稳定的颈环结构,而加入靶物后,MTB 16sDNA与MBs-Hp1的互补杂交促使Hp1颈环结构打开并进一步与TAMRA-Hp2杂交形成稳定双链结构。与此同时,MTB 16sDNA从MBs-Hp1上解链进入下一个循环,进而实现MBs-Hp1的超灵敏定量检测。在最佳实验条件下,MTB 16sDNA在0.05~150 nM浓度范围内,荧光强度与MTB 16sDNA浓度呈现良好的线性关系,线性相关系数为R~2=0.990(n=8),检测限为27 pM(3σ/K)。加标回收率在94.4%~100.4%之间,准确度高。(2)构建基于杂交链式反应(Hybrid chain reaction,HCR)和MBs的MTB保守序列检测方法。经典的HCR反应包括两个DNA发夹探针,无靶物时,探针稳定为颈环结构。而当加入靶物后,靶物与发卡探针的结合促使颈环结构打开并引发后续的链式反应,随后两个发卡探针自组装成高度有序的DNA双螺旋结构,同时修饰在DNA双螺旋上的荧光信号分子也精确地同步扩增,从而实现靶物的超灵敏度定量检测。在最优的反应条件下,当靶物MTB 16sDNA在0.01?100 nM浓度范围内,体系荧光强度与其浓度呈现良好的线性关系,相关系数R~2=0.993,检测限为5.3pM(3σ/K)。本方法还能够成功区分碱基错配的DNA,显示出其在单碱基多态性分析中的应用潜能。此外,通过简单的热变性和复性处理,MBs-H1探针可重复使用,使本方法的成本进一步降低。与已有的基于核酸扩增技术的快速检测方法相比,本文开发的两种结核分枝杆菌特定基因序列检测方法同样具有简单快速、灵敏度高、选择性好等优点,更为重要的是,无需酶参与,从而大大降低了检测成本。这将为实现MTB的快速早期诊断提供新的技术支持。