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法氏囊是目前世界上唯一公认的体液免疫中枢免疫器官,是B淋巴细胞分化发育和成熟的场所。法氏囊中含有许多生物活性物质,不仅对禽类免疫具有调节作用,还调节哺乳动物和人类的免疫反应。其他法氏囊活性肽相继报道,如法氏囊肽-1(Tyr-Glu-Glu)、法氏囊肽-2(Trp-Thr-Ala-Glu-Glu-Lys-Gln-Leu)、法氏囊五肽(BP5,CKDVY)、法氏囊七肽(BSP-Ⅱ,TPSGLVY)等。虽然这些活性肽都对体液免疫产生一定的影响,但它们也有各自不同的功能。在生物体中,代谢过程、免疫系统和神经内分泌系统之间相互影响、相互配合,维持机体的生理动态平衡。因此,法氏囊活性肽的免疫调节功能和其他功能都非常值得进行研究。但至今,法氏囊活性肽及其机理的研究较少。由于法氏囊活性肽具有重要的免疫调节活性以及法具有广泛的生物学活性,因此,法氏囊活性肽的研究具有非常广阔的应用领域和非常重要的应用价值,同时,对于深入了解法氏囊的免疫调节机理及其他生理功能具有重要的理论意义。 本研究充分利用先进的生物技术和分析方法,攻克了法氏囊成分复杂、纯化困难的技术难题,新分离到5种法氏囊活性肽,并对这些分子进行了系统的研究,包括体液免疫、细胞免疫、免疫调节作用机制、B细胞分化调控机制、物质代谢、信号转导等多方面的研究。本研究主要内容包括: 1、新的法氏囊多肽分离、纯化和鉴定 法氏囊是禽类特有的免疫器官,是B细胞分化发育和成熟的场所,其提取物中含有多种活性物质,具有广泛的生物学活性。本试验以鸡法氏囊为原料,通过分子筛(Sephadex)和反相高效液相色谱(RP-HPLC)等步骤,从法氏囊中分离纯化得到了五种新的活性肽:即法氏囊八肽(BP8: AGHTKKAP)、法氏囊十一肽(BP11:DVAGKLPDNRT)、法氏囊肽1(BP-Ⅰ: ALPVVVII)、法氏囊肽2(BP-Ⅱ: DRATHGGE)和法氏囊肽3(BP-Ⅲ: GANEVEEER)。 2、法氏囊活性肽的免疫调节作用的研究 为了进一步研究新分离的法氏囊多肽的免疫调节活性,分别检测法氏囊8肽(BP8),法氏囊11肽(BP11),法氏囊肽1(BP-Ⅰ)、法氏囊肽2(BP-Ⅱ)、法氏囊肽3(BP-Ⅲ)对鸡体内免疫调节的影响和小鼠体内免疫调节的影响。实验结果显示,法氏囊8肽(BP8)、法氏囊11肽(BP11)、法氏囊肽1(BP-Ⅰ)、法氏囊肽2(BP-Ⅱ)、法氏囊肽3(BP-Ⅲ)均明显促进免疫小鼠体内和鸡只体内抗体水平升高,调节细胞因子的产生,调节T细胞亚型中CD3+CD4+和CD3+CD8+的比例。这些结果证实新分离的五种法氏囊活性肽均具有免疫调节活性。不过,具体机理和应用还需进一步研究。 3、法氏囊活性肽调节B细胞分化的作用研究 法氏囊是体液免疫中枢免疫器官,是B淋巴细胞分化和成熟的场所。为了进一步研究新分离的法氏囊多肽对B细胞分化的影响,通过CFU pre-B实验、小鼠B细胞分化模型和动物实验模型,分别检测法氏囊8肽(BP8),法氏囊11肽(BP11),法氏囊肽1(BP-Ⅰ)、法氏囊肽2(BP-Ⅱ)、法氏囊肽3(BP-Ⅲ)对B细胞分化的影响。实验结果显示,法氏囊8肽(BP8)、法氏囊11肽(BP11)、法氏囊肽1(BP-Ⅰ)、法氏囊肽2(BP-Ⅱ)、法氏囊肽3(BP-Ⅲ)均明显促进B细胞的分化,调节小鼠B细胞的亚型。其中BP8上调pre-B细胞和iMB/MB细胞的比例,BP11上调iMB/MB细胞的比例。这些结果证实新分离的五种法氏囊活性肽均具有调节B细胞分化的作用。不过,具体的作用机制还需进一步研究。 4、法氏囊活性肽调节B细胞分化及调节机理的研究 法氏囊是B细胞增长和分化的中枢。然而,法氏囊调节B细胞分化的分子调节机制还不清楚。我们的结果显示,BP8调节CFU pre-B的形成,绑定B细胞前体,体内和体外调节B细胞分化,调节抗体生成。基因芯片分析显示BP8调节1572个基因的差异表达,主要调节视黄醇代谢通路,Wnt信号通路,MAPK通路,Jak-Stat通路,Notch通路,细胞因子受体互作通路,和钙离子通路。最后,BP8提高ADH7和RDH10的表达,与RBP4相互作用,调节视黄醇代谢。这些结果显示BP8是新的B细胞调节因子,并提供了一个B细胞分化与视黄醇代谢的纽带。 5、法氏囊五肽调节B细胞分化及抗过氧化机理的研究 BP5是从鸡法氏囊中提取的一种新的天然活性肽,并在前面的实验中被证明对机体具有免疫调节作用。本实验发现BP5显著性提高CFU pre-B的集落形成,调节B细胞分化。同时,调节B细胞的氧化还原环境。通过二维电泳和MALDI-TOF/TOF,初步揭示了BP5调节B细胞活性的机理。BP5主要调节氧化还原辅酶代谢过程、蛋白酶体、RNA剪贴和转录等。BP5还调节G6PD的表达和活性,从而上调DNA修复的能力。 6、法氏囊不同阶段的RNA-Seq分析 法氏囊是禽类的体液免疫中枢免疫器官,在B细胞分化中起到主要作用。为了更好的理解B细胞在法氏囊中的分化、迁移的分子机理,我们对法氏囊从胚胎期到成熟期的基因转录水平进行了研究。我对胚胎第十天(ED_10)、出生第二天(Day_2)和出生第21天(Day_21)进行建库分析,我们得到了超过70million的高质量的reads。ED_10,Day_2和Day_21特异性比对上的序列分别为71087280,59167491和70263675。这些序列主要参与视黄醇代谢通路、肌动蛋白细胞骨架调节通路、Wnt信号通路、MAPK信号通路、Jak-STAT信号通路、Notch信号通路和Toll-like信号通路等通路。RNA-Seq分析为研究法氏囊不同阶段的基因差异提供了一种强大的工具。这些数据为进一步研究法氏囊发育及其法氏囊微环境的调节作用提供了珍贵的数据,为法氏囊活性肽来源的研究奠定基础。 综上所述,法氏囊活性肽不仅对研究中枢体液免疫系统具有极其重要的指导作用,而且对研究机体正常生理过程和各种重大疾病如遗传病、代谢性疾病等的发病机制的分子基础具有重要意义,同时对临床应用研究具有重要的实践指导意义。