本实验通过构建T-DNA插入突变体库筛选灰葡萄孢细胞壁合成缺陷突变株,以及通过基因敲除技术研究细胞壁几丁质合酶Ⅵ(BcchsⅥ)基因功能,目的是对灰葡萄孢细胞壁合成相关基因进行解析。实验利用带有双元载体ATMT1的农杆菌转化灰葡萄孢B05.10,筛选潮霉素抗性的转化子,经单孢分离和传代后得到234株遗传稳定的灰葡萄孢T-DNA插入突变株。用荧光增白剂Calcofluor White(CFW)对上述234株突变株进行细胞壁合成缺陷突变株的筛选,并获得了 3株对CFW敏感性(B-117、B-169、D-9)和 1 株对 CFW 抗性(B-62)的突变株。在进一步观察Sorbitol、SDS、NaCl对CFW敏感性突变体的影响实验中,发现1.2M Sorbitol对B-117和D-9的生长缓慢有挽救作用,野生型和B-117在NaCl培养基上的生长受到抑制。在孢子萌发实验中,B-62表现为菌丝长度和直径明显增加并出现了分枝,D-9的孢子膨大、菌丝较粗、长度增加而且不弯曲。在番茄感染实验中,D-9突变株侵染番茄的毒力大幅度减弱而B-62致病性却有所增强。由此推测B-62和D-9突变株与细胞壁缺损以及致病性有关。由于丝状真菌几丁质合酶Ⅴ和Ⅵ对于细胞壁几丁质合成十分重要,本研究室已对灰葡萄孢的几丁质合酶V基因开展了研究,但是发现几丁质合酶V基因敲除后几丁质含量增加了 31%,而致病力无明显变化。为了探明灰葡萄孢几丁质合酶Ⅵ基因功能,本实验利用Gateway技术构建几丁质合酶Ⅵ基因(BcchⅥ)敲除双元载体pCAMBIA-Bar-△chs6,以农杆菌介导法转化灰葡萄孢B05.10,得到9株潮霉素抗性突变株。经表型和分子鉴定后发现除第4号突变株(△4)外,其它的潮霉素突变株均为BcchsⅥ基因敲除突变体,推测△4突变株可能为异常插入突变株。实验对△2BcchsⅥ基因敲除突变株进行了详细研究,结果表明BcchsⅥ基因敲除突变株的几丁质含量下降了 22.5%、对CFW敏感、Sorbitol的生长挽救作用明显、产孢显著减弱、对蕃茄叶片的致病性下降。目前,对灰葡萄孢BcchsⅥ基因功能的解析仍在进行中。