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肝癌的发生率与死亡率在全球范围内都位居前列。目前肝癌的一线治疗推荐药物只有Sorafenib和Lenvanix,这两种药物属于小分子的多靶点酪氨酸激酶抑制剂,但是其疗效有限,因此研发针对肝癌的免疫治疗药物被寄予厚望。GPC3是硫酸乙酰肝素蛋白家族的成员,它参与了Wnt、Hedgehog、骨形态发生蛋白和FGF等信号通路的调控,从而控制细胞在不同发育阶段的增殖与凋亡。GPC3基因的表达具有发育阶段和组织的特异性,在胚胎期的多个组织中特异性表达,在成体组织中丧失表达。但是,GPC3在成体的肿瘤组织如肝癌、结直肠癌、神经细胞瘤等均有特异性表达,而在正常肝脏组织中表达量低,甚至不表达。肝癌中上调表达的GPC3能促进肝癌细胞的增殖和迁移,并与患者的不良预后高度相关。本课题组前期的研究发现中和性抗体HN3通过阻断GPC3介导的信号通路抑制肝癌细胞的增殖,靶向GPC3的免疫毒素和抗体-药物偶联物（antibody-drug conjugate,ADC）可以特异性地杀死肿瘤细胞。因此,GPC3是一个理想的肝癌免疫治疗的靶点。HN3是一种靶向GPC3的人源抗体,研究表明HN3可以结合在GPC3核心蛋白的N端与C端形成的构象表位,HN3能阻断生长因子的结合并引发细胞内信号传导,使YAP失活并抑制肝癌细胞增殖。HN3与GPC3蛋白结合特异性高,亲和力为0.3 nmol/L,HN3可以在体外直接抑制GPC3阳性的肝癌细胞系的生长,也可以抑制小鼠体内GPC3阳性异种移植瘤的生长。基于HN3的免疫毒素对肝癌细胞的杀伤活性更强,IC50一般在100 ng/mL以下。但是抗体的亲和力与其活性密切相关,抗体的亲和力提高后,抗体中和活性与免疫毒素活性都能得到提高,因此,本研究采用优化抗体CDR区域氨基酸序列组成的策略,以提高HN3的亲和力。本研究的主要内容是设计引物依次突变HN3的三个CDR区域,通过突变体文库的构建与筛选,获得了多个亲和力显著高于HN3的突变体。以HN3为对照,验证HN3突变体裸抗与GPC3蛋白的结合活性,与GPC3阳性细胞系的结合活性,以及在体外抑制肿瘤细胞增殖的活性。随后制备了基于HN3突变体的重组免疫毒素,测试了免疫毒素的亲和力,体外杀伤肿瘤细胞的活性以及体内抑制肿瘤生长的活性。获得的结果如下:1.通过突变HN3的3个CDR区域,构建并筛选突变体文库后得到192条亲和力成熟的HN3突变体序列。对这些突变体序列进行比对和分析后选择了5条代表性序列进行后续研究:CDR3区突变的GN4和GN5,以及CDR1、CDR2、CDR3区均突变的HL03、HL49和JW31。2.成功表达并纯化了HN3以及HN3突变体抗体,通过ELISA和流式细胞术测试了HN3突变体裸抗蛋白与GPC3蛋白以及GPC3阳性细胞系的结合。5个HN3突变体裸抗蛋白均能有效结合GPC3蛋白,其中JW31-hFc的EC50为0.042nmol/L,比HN3-hFc提高了4.1倍;HL49-hFc的EC50为0.054 nmol/L,比HN3-hFc提高了3.2倍。5个HN3突变体裸抗蛋白均能有效结合GPC3阳性的细胞系,HL49-hFc在所有GPC3阳性细胞系上的结合能力均显著强于HN3-hFc。3.HN3突变体裸抗蛋白在体外对GPC3阳性肿瘤细胞增殖的抑制实验发现HL03-hFc的抑制作用强于HN3-hFc。HL03-hFc在Huh7、HepG2、Hep3B上的IC50值比HN3-hFc分别提高了6倍、3.1倍和1.9倍。4.表达并纯化了重组免疫毒素,通过ELISA测试了HN3突变体重组免疫毒素与GPC3蛋白的亲和力,5个重组免疫毒素都能有效结合GPC3蛋白,其中HL49-PE24的结合活性最强,其EC50为1.729 nmol/L,比HN3-PE24提高了1.2倍。重组免疫毒素的细胞杀伤实验显示,GN4-PE24、GN5-PE24和HL49-PE24的杀伤活性强于HN3-PE24。其中活性最强的免疫毒素为HL49-PE24,在Hep3B、HepG2、Huh7上的IC50分别为5.600 nmol/L、5.842 nmol/L、1.149 nmol/L,比HN3免疫毒素分别提高了1.5、2.1和6.6倍。GN4-PE24、GN5-PE24在不同细胞系中的杀伤活性比HN3提高了1.5-2.5倍。5.在G1荷瘤小鼠的抑瘤实验中,瘤内和尾静脉注射5 mg/kg的免疫毒素,结果显示HL49-PE24比HN3-PE24抑瘤活性强,在5只HL49-PE24治疗的小鼠中,有3只肿瘤完全消除。尾静脉注射同样剂量的免疫毒素显示,HL49-PE24的抗肿瘤反应仍然强于HN3-PE24,但是弱于瘤内注射。总之,通过突变HN3的CDR区,本课题获得了5条代表性的HN3突变体（GN4,GN5,HL03,HL49,JW31）,并制备了裸抗和重组免疫毒素。其中,JW31-hFc和HL49-hFc对GPC3蛋白的结合活性强于HN3-hFc,且HL03-hFc抑制GPC3阳性肿瘤细胞增殖的活性强于HN3-hFc。在5个HN3突变体免疫毒素中,HL49-PE24、GN4-PE24和GN5-PE24对GPC3阳性肿瘤细胞的杀伤活性强于HN3-PE24。在G1荷瘤小鼠的抑瘤实验中,瘤内注射5 mg/kg HL49-PE24,5只经过治疗的的小鼠中有3只肿瘤短暂性消除,在后续的观察中有1只未观察到肿瘤复发。这些亲和力成熟的突变体提高了识别和结合肿瘤抗原的能力,体内外的抑瘤实验显示基于这些突变体的裸抗和免疫毒素对肝癌细胞系的抗肿瘤活性明显提高,在肿瘤免疫治疗中具有一定的应用潜力。该研究结果为进一步开发基于HN3治疗性抗体的免疫治疗技术或药物提供了基础,为肝癌的治疗提供新的思路与实验方法。