【摘 要】
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线粒体是呼吸作用的主要场所,除了为细胞供能外,还参与细胞中其他重要功能,这些功能主要由线粒体蛋白执行。99%的线粒体蛋白都是在细胞核内编码,然后在核糖体翻译后经线粒体膜上的蛋白质机器协同转运分选到线粒体的不同区室。这些蛋白有5条分选途径:前导肽途径（Presequence pathway）、载体蛋白途径（Carrier pathway）、β桶蛋白途径（β-barrel pathway）、α螺旋蛋白
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线粒体是呼吸作用的主要场所,除了为细胞供能外,还参与细胞中其他重要功能,这些功能主要由线粒体蛋白执行。99%的线粒体蛋白都是在细胞核内编码,然后在核糖体翻译后经线粒体膜上的蛋白质机器协同转运分选到线粒体的不同区室。这些蛋白有5条分选途径:前导肽途径（Presequence pathway）、载体蛋白途径（Carrier pathway）、β桶蛋白途径（β-barrel pathway）、α螺旋蛋白途径（α-helical pathway）及半胱氨酸富集蛋白途径（Cys-rich pathway）。这些途径主要由外膜上的3大转位酶复合物（TOM、SAM和MIM）和内膜上的4大转位酶复合物（TIM23、TIM22、OXA和MIA）介导完成。线粒体内膜TIM23复合物负责转运约60%的线粒体蛋白,这些蛋白分布于线粒体基质和内膜,在线粒体氧化呼吸和能量代谢中发挥着重要的作用。目前关于酵母TIM23复合物已经鉴定出11个组分,通过2种不同组成形式(TIM23Sort和TIM23Motor)将蛋白分别转运到内膜或者基质中。TIM23复合物组分较多,组成形式复杂,其表达与纯化难度较大,目前已有的结构生物学研究大都针对单个亚基,仅能提供有限的信息,且其具体的转运机制尚不清楚。本研究拟获取酿酒酵母内源TIM23复合物蛋白样品,探索TIM23复合物转运中间态的捕获条件,为解析TIM23复合物的结构和阐明机制奠定基础。主要研究内容包括:利用酵母内源性表达纯化方法构建酿酒酵母Tim23 C-TAP菌株;大量培养Tim23 C-TAP菌株后在原位提取纯化酵母TIM23复合物,获得纯度高、性质较好的TIM23蛋白;同时也利用哺乳细胞异源表达体系成功表达TIM23所有组分,并获取了Tim23-Tim17-Tim50的核心复合物;利用不同的底物蛋白筛选TIM23复合物转运底物的中间态捕获条件,通过表达不同的融合sf GFP的底物蛋白,随后利用酿酒酵母线粒体对底物进行体外转运,成功捕捉到TIM23复合物结合底物中间状态。因此,该研究为之后进一步解析TIM23复合物的结构及阐释其工作机制奠定基础。
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