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随着生物技术的发展,以基因重组技术为基础的基因工程制药成为医疗行业的重要发展方向。其中,豹蛙抗瘤酶（ONC）是一种对肿瘤细胞有很强杀伤力的核糖核酸酶。但临床试验用的豹蛙抗瘤酶来自天然提取物,来源有限,产量极低,限制了其广泛应用,用基因工程方法解决该问题势在必行。另一方面,人血清白蛋白（HSA）有广泛的生物学作用,若能用基因工程方法制备高表达重组HSA必将有重要的医疗价值和经济意义。若能进一步把ONC的抗肿瘤作用与HSA的广泛生物作用结合起来,制备出一种高活性和高表达特性的融合蛋白,将产生巨大的经济效益、社会效益和医疗价值。为此,本研究组已构建了融合蛋白HSA-ONC的毕赤酵母工程菌,得到了高表达的融合蛋白HSA-ONC。为进一步提高HSA-ONC的表达量、抗肿瘤活性和对肿瘤细胞的选择性,本文拟通过在HSA和ONC之间加上特定连接肽实现上述目标。本文在现有融合蛋白连接（GGGGS）n基础上,加入KEEEK,形成具有高度正负离子化和高度亲水性的G4SKEEEKG4S连接肽。期望该连接肽即不影响它连接的两个蛋白的活性,又有利于保持甚至提高两个蛋白的表达量和对肿瘤细胞的选择性。在构建表达融合蛋白HSA-G4SKEEEKG4S-ONC工程菌时,利用本实验室构建的pPIC9K?HSA和pPIC9K?ONC重组质粒,在HSA和ONC之间加上连接肽G4SKEEEKG4S。具体方法是:设计引物,用重叠PCR技术合成HSA-G4SKEEEK G4S-ONC序列,构建重组（扩增）质粒pMD20-T?HSA-G4SKEEEKG4S-ONC,将其转入大肠杆菌DH5α受体菌中,进行阳性克隆筛选和鉴定。然后将鉴定正确的阳性菌扩大培养,提取（扩增）质粒,用它构建重组（表达）质粒pPIC9K?HSA-G4SKEEEKG4S-ONC,将其转入大肠杆菌DH5α受体菌中,进行阳性克隆筛选和鉴定,取正确的菌株扩大培养,提取重组（表达）质粒转入GS115毕赤酵母细胞,构建GS115?pPIC9K?HSA-G4SKEEEKG4S-ONC毕赤酵母工程菌,进行阳性克隆筛选和鉴定,取正确的毕赤酵母工程菌GS115?pPIC9K?HSA-G4S KEEEKG4S-ONC用于后续实验。在表达融合蛋白HSA-G4SKEEEKG4S-ONC时,将GS115?pPIC9K?HSA-G4SKEEEK G4S-ONC毕赤酵母工程菌进行扩大培养,然后进行发酵培养,1%甲醇诱导表达。诱导5d后,将发酵液离心,取上清按SDS-PAGE方法检测融合蛋白HSA-G4SKEEEKG4S-ONC的表达情况。在分离纯化融合蛋白HSA-G4SKEEEKG4S-ONC时,取含融合蛋白HSA-G4SKEEEK G4S-ONC的发酵液上清进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,其中,分离胶浓度为10%,电压为90V于环境温度为4℃,电泳结束后,根据目的蛋白在胶板中位置切下目的蛋白,匀浆,洗出目的蛋白,离心收集上清,真空冷冻干燥,得到融合蛋白HSA-G4SKEEEKG4S-ONC粉末,置于-80℃保存备用。在测定融合蛋白HSA-G4SKEEEKG4S-ONC的生物活性时,用0μM、0.1μM、0.2μM、0.5μM、0.8μM、1μM、1.5μM、2μM浓度的融合蛋白HSA-G4SKEEEKG4S-ONC处理体外培养24h的大鼠肝癌细胞CBRH-7919,用MTT显色法检测药物处理24h后的细胞活性,结果表明随着药物浓度的增加,细胞活性逐渐减弱,并且呈浓度的依赖性。用流式检测细胞周期相的分布和凋亡率,结果表明经融合蛋白HSA-G4SKEEEKG4S-ONC处理过的大鼠肝癌细胞CBRH-7919,处于G0/G1期的细胞比例比对照组高,而处于S期和G2/M期的细胞比例开始减少,融合蛋白HSA-G4SKEEEKG4S-ONC处理组的细胞凋亡率较对照组明显增加;用Western Blot检测细胞内c-Jun和BAX蛋白的表达变化,结果表明细胞增殖相关蛋白c-Jun表达下调,促进细胞凋亡相关蛋白BAX表达上调,说明融合蛋白通过调节细胞增殖/凋亡相关蛋白表达抑制肝癌细胞活性。综上,本文设计了G4SKEEEKG4S连接肽,构建了重组（扩增）质粒pMD20-T?HSA-G4SKEEEKG4S-ONC、重组（表达）质粒pPIC9K?HSA-G4SKEEEKG4S-ONC和GS115?pPIC9K?HSA-G4SKEEEKG4S-ONC毕赤酵母工程菌,用它表达出了融合蛋白HSA-G4SKEEEKG4S-ONC。分离纯化该蛋白并检测其生物学作用,发现融合蛋白抑制CBRH-7919的增殖并且促进其凋亡,并且通过调节细胞增殖/凋亡相关蛋白表达抑制肝癌细胞活性。