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胃癌是一种人类常见的消化道恶性肿瘤，其发病率位居肿瘤第四位。每年全球有70万人死于胃癌，胃癌是引起肿瘤相关死亡的第二大杀手。我国为胃癌高发地区，主要分布在西北和沿海地区。目前胃癌的治疗效果不理想，5年生存率小于20％。主要原因是就诊时已到晚期；胃癌细胞对现有的化疗药物不敏感。因此深入研究胃癌的病因及发病机制，对胃癌的预防与治疗有着迫切与重要的价值。
越来越多学者认为肿瘤是基因病，必须探明肿瘤发病的分子机制才能从根本上控制肿瘤的发生和发展。胃癌的发生与发展与其它肿瘤一样，是一个多因素作用、多基因参与、多阶段发展的疾病；基因组不稳定是其重要特征。基因组不稳定在染色体水平表现染色体易位、扩增和缺失等；在核酸水平表现为基因的突变、基因缺失和扩增、微卫星不稳定、表观遗传异常引起的基因沉默。基因组不稳定引起癌基因激活、抑癌基因失活以及凋亡相关基因失衡等；细胞生长、增殖、分化和凋亡等过程的失调控。分子生物学和细胞遗传学研究进一步证实胃癌的发生、演进是多种基因突变累积的结果，其中癌基因激活及抑癌基因失活发挥着关键作用。
基因扩增(geneamplification)是原癌基因激活的主要方式。原癌基因的扩增和过度表达为肿瘤细胞生长提供选择优势，促进了肿瘤的发生与演进。基因缺失(geneloss)是抑癌基因失活的重要方式。抑癌基因的缺失丧失了该基因在细胞周期、细胞增殖和细胞稳定维持等多方面的调控功能，从而促进了肿瘤的发生。胃癌细胞系及胃癌组织中均存在着复杂的染色体改变，主要表现为肿瘤染色体特异部位的扩增和缺失，导致了癌基因激活及抑癌基因失活。因此染色体高频扩增区很可能存在癌基因并由于扩增而激活；而频繁出现基因等位缺失的染色体区域可能存在着肿瘤抑癌基因并失活。所以从筛选和定位染色体特异区域的扩增和缺失入手，可以寻找、确定与胃癌相关的癌基因以及抑癌基因。
应用CGH技术检测不同发展阶段的肿瘤染色体异常，不但可以了解肿瘤发生发展的分子基础，而且可为肿瘤的诊断和预后判断提供遗传标志。更为重要的是以CGH发现的染色体异常区域为基础，可在扩增或丢失的染色体区域中明确新的与肿瘤相关的癌基因或抑癌基因。我们课题组曾应用CGH技术检测了62例原发性胃癌染色体拷贝数的改变，结果显示染色体高频扩增的区域是8q、20q、13q、和3q；高频缺失区域位于19p、17p、1p。进一步的分析发现19p缺失全部出现在印戒细胞癌中。基于以上的结果本研究应用高分辨、高通量的比较基因组杂交微点阵(CGH-array)技术，设计独特基因组DNA微点阵，包含650个人工细菌染色体克隆(BAC)，以精确地定位胃癌肿瘤染色体异常的部位，挑选具有明确临床病理意义的染色体异常区域，通过DNA荧光原位杂交(FISH)技术进行验证。用蛋白印迹技术(westernblot)、组织微点阵(TMA)和免疫组织化学技术(IHC)检测相关基因的蛋白表达的变化，分析其临床意义。
本文的目的在于筛选、定位与胃癌相关的癌基因的扩增以及抑癌基因的缺失，结合相关基因的蛋白表达的变化，探讨可能的致癌机制，为阐明胃癌的发生、发展机制提供研究基础。全文共分为四个部分：
一、比较基因组杂交微点阵(CGH-array)技术检测胃癌分子遗传学改变收集30例新鲜胃癌组织，包括癌组织和癌旁正常胃粘膜组织。提取基因组DNA，用随机引物PCR的方法扩增样本DNA和参考DNA，分别标记Cy3和Cy5于上述PCR产物上，与微点阵BAC克隆DNA进行杂交。用GenePix分析软件分析Cy3:Cy5的比值，判断染色体拷贝数的改变。
结果发现：有28例样本获得满意结果。胃癌组织中染色体DNA扩增的频发区域依次出现于：16q21(53.6％)、19q13.1(42.9％)、5p15.4(32.1％)、3q26.3(28.6％)、3q21(25.0％)、13q14-13q21(25.0％)、13q21.1(25.0％)、3q13.3(21.4％)、19q13.1-13.2(21.4％)。缺失的频发区域依次出现于：19q13.3(67.9％)、3q21(64.3％)、3p21(57.1％)、3p22(53.6％)、3p14(50.0％)、13q21.33(39.3％)、5p15.3(35.7％)、16q24.3(35.7％)、19p13.3(35.7％)、13q31(28.6％)。10例出现19p13.3缺失，其中8例组织学类型为弥散型。该结果与我们以往研究一致，提示19p13.3可能包含着与胃癌发生有密切联系的抑癌基因。
二、荧光原位杂交(FISH)验证胃癌组织中染色体19p13.3缺失收集49例胃癌组织的石蜡切片，根据前面的CGH-array和CGH的结果，选取染色体19p13.3的BAC克隆RP11-75H6为探针。BACDNA以红色荧光标记，制备成荧光探针；在组织切片上进行间期核FISH杂交，荧光显微镜下观察，每50个细胞中低于1个红色信号就认为存在缺失。
结果如下：在49例胃癌样本中有25例(51％)出现19p13.3的缺失。在32例组织学为弥散型胃癌中有17例存在19p13.3的缺失(53.1％)。而16例肠型胃癌中7例出现缺失(43.7％)。虽然差异没有达到统计学的标准，但我们看到19p13.3的缺失较易出现在弥散型中。胃癌中19p13.3的缺失是频发事件，19p13.3的缺失与男性发病相关。该区可能存在某些抑癌基因与弥散型胃癌的组织学发生有内在的联系。BACRP11-75H6包含ZIP激酶基因该基因调节细胞的凋亡和自噬，与细胞的死亡密切相关，筛选此基因作进一步的研究。
三、蛋白印迹(WB)及免疫组化(ICH)检测ZIP激酶蛋白在胃癌组织的表达收集新鲜胃癌组织27例，提取癌组织和癌旁正常组织蛋白质应用westernblot检测ZIPk的表达。
结果如下：27例癌旁组织均检测到ZIPk蛋白的表达，肿瘤组织中有8例ZIPk蛋白表达减少，占29.6％。低分化腺癌中有5例，中分化腺癌中有2例，1例印戒细胞癌都出现明显ZIPk表达减少。I期病例无ZIPk表达减少，II期有2例，IIIa期2例，IIIb期2例，IV期2例。晚期病例出现ZIPk表达减少的比例较中期高(44.4％：25％)，但统计学分析没有性显著差。
在胃癌组织芯片上应用免疫组织化学方法，检测ZIP激酶编码的蛋白在胃癌中的表达情况，并分析ZIP激酶表达异常与临床病理的联系，同时探讨ZIP激酶表达异常对胃癌病人预后的影响。结果如下：
应用免疫组化检测161例癌组织和80例癌旁胃粘膜组织ZIP激酶基因的表达。有78例癌旁胃粘膜组织存在较强胞浆内ZIP激酶基因的表达(97.5％)。50例胃癌肿瘤组织中有高水平的表达(28.5％)，27例低表达(16.8％)，84例弱或不表达(52.2)％。
分析临床病理资料显示ZIP激酶的低或不表达与组织学类型相关(p<0.007)，其中17例印戒细胞癌中未发现ZIP激酶的表达，与弥散型组织学类型相关(p=0.045)。ZIP激酶的低或不表达与肿瘤的浸润深度(p<0.001)、TMN分期(p<0.001)、肿瘤的转移(p<0.001)密切相关。通过生存分析显示正常ZIP激酶表达组5年生存率为62％，生存时间的中位数为71.5月。ZIP激酶低或不表达组5年生存率为37.8％，生存时间的中位数为32.6月。Kaplan-Meier分析表明高表达组的总体生存时间和癌症特异的生存时间均较低或不表达组长。log-rank(COX-Mantel)检验示差别具有统计学意义(p<0.001)。在COX模型中，单因素分析ZIP激酶低或不表达是影响胃癌病人长期生存的风险因素。在多因素分析中ZIP激酶的影响并不明显，ZIP激酶并不是作为一个独立因素影响胃癌病人的预后，而是通过影响肿瘤的浸润和转移影响预后。
四、末端标记技术(TUNEL)检测不同ZIP激酶表达组胃癌肿瘤细胞的凋亡56例胃癌样本根据免疫组化结果分为ZIP激酶高表达组(28例)和不表达组(28例)，应用末端标记法显示凋亡细胞。观察500-1000个细胞，计算凋亡指数均数。
结果如下：ZIP激酶高表达组凋亡指数均数5.8±0.38％，不表达组凋亡指数均数1.8±0.379，差异具有显著性(p<0.001)。
根据上述结果，我们得出如下结论：
1.染色体16q21、19q13.1、5p15.4、3q26.3、3q21、13q14-13q21、13q21.1、3q13.3、19q13.1-13.2的扩增以及19q13.3、3q21、3p21、3p22、3p14、13q21.33、5p15.3、16q24.3、19p13.3、13q3的缺失是胃癌发展过程中的频发事件，提示这些区域可能存在癌基因的扩增与抑癌基因的缺失，并与胃癌发生与发展相关。
2.胃癌中19p13.3的缺失是频发事件，19p13.3的缺失与男性发病相关。19p13.3缺失在弥散型胃癌，尤其是印戒细胞癌出现的机率高。19p13.3缺失在有转移的病例中出现的机率高。
3.ZIP激酶基因是一新的肿瘤抑制基因，与胃癌的组织学类型、进展、转移和预后相关。
4.ZIPk调节胃癌细胞的凋亡，ZIPk通过诱导细胞凋亡而抑制肿瘤的生长。ZIPk缺失有助于胃癌细胞的生长和增殖。