MicroRNA (miRNA)亦称微小RNA,是一类内源性非编码的小RNA,它主要通过与其靶基因mRNA 3’-UTR区(mRNA的3’非翻译区)互补配对,从而发挥沉默特定靶基因作用。越来越多的研究证据显示,miRNA广泛存在于各种动物、植物和病毒中,在人类等哺乳动物中至少有三分之一的基因(大约1万多条基因)受miRNA调控。研究结果显示,miRNA在生物体的发育、增殖、分化、凋亡、寿命、免疫反应特别是肿瘤发生等方面发挥着极为重要且必不可少的调节功能。随着研究的深入,越来越多的miRNA被发现和报道,其中,大量研究结果发现miRNA表达与多种肿瘤的发生、发展、转移及预后密切相关。有很多学者认为miRNA的改变可能在大量,乃至所有人类(及小鼠)肿瘤的病理生理中发挥着极为关键性的作用,甚至有人提出miRNA的异常是最重要肿瘤起源之因。辐射致癌效应是电离辐射严重的远后效应之一,也是广大涉核职业人员和民众十分关心的问题。本实验室从1999年开始进行了辐射诱导肿瘤的机理研究,我们通过改良分次照射诱导小鼠发生胸腺T淋巴瘤型白血病,成功建立了辐射致癌的Balb/c(和C57)小鼠模型,并研究了辐射诱导肿瘤过程中许多表达差异基因和差异蛋白的改变。然而以上研究主要是某些已经功能明确的癌基因抑制基因在辐射致癌组织中的表达验证研究,离完全阐明辐射致癌发生的分子机制还有很大的距离。这里还要特别指出的是,电离辐射是已知的重要物理致癌因子,其诱导肿瘤发生的分子机制远未阐明,对辐射致癌机理的研究不仅具有重要的军事应用价值,还有助于放射线的和平利用和我国核能事业的大发展,因此有必要利用当代生命科学的新发现、新理论、新技术对辐射致癌机理进行深入探索。特别是,关于miRNA在辐射致癌发生、发展中作用及通过调控]miRNA表达的方法预防和治疗辐射诱导的肿瘤的研究目前尚未见报道,本文将就这一重要问题进行初步探讨。第一部分辐射致癌中差异表达miRNA的筛选及验证为探讨辐射致癌组织与正常组织之间的miRNA表达谱差异,我们以辐射致癌的Balb/c小鼠模型为研究对象,首先利用Affymetrix miRNA芯片检测的方法检测了不同辐射致癌组织与正常胸腺组织的miRNA表达情况。应用聚类分析法发现,辐射致癌组织与正常组织的总体miRNA表达谱有非常明显的差异；进而应用SAM软件统计分析发现在各样本中表达重复性较好、表达丰度高、差异2倍以上且P<0.001的miRNA共68条,其中辐射致癌组织中表达上调的miRNA有48条,下调20条。最后,我们通过扩大样本Real Time-PCR方法验证获得了20条左右差异表达的miRNA。与对照正常胸腺组织相比,辐射致癌T淋巴瘤组织中上调最明确的miRNA是miR-762, miR-21, miR-17-92簇,niR-106-363簇和miR-23a/b等；而辐射致癌T淋巴瘤组织中下调最明确的miRNA是niR-200c, miR-486, miR-199a/b, miR-143, miR-152, miR-125b, miR-31, miR-26, miR-100和let-7等。本部分实验结果表明,辐射致癌组织有众多miRNA的表达异常,且miRNA可能参与了辐射致癌的发生。第二部分辐射致癌相关miRNA的作用初步探索鉴于大量研究结果表明,miRNA主要通过特异性抑制其靶基因3’UTR的方式来发挥其功能。因此靶点的鉴定研究是miRNA研究的核心工作之一,本部分工作中我们对部分辐射致癌相关miRNA的新靶点进行了试探性的研究工作。1. miRNA23,辐射致癌发病与诊断相关的新的miRNA分子标签首先我们选择miRNA23进行研究,这是因为它在所有辐射致癌组织中上调表达的miRNA中表达丰度最高并且上调倍数较高,且其在肿瘤中的功能不明,特别是miRNA23在多种肿瘤中表达下调而在辐射致癌组织中表达特异性上调,是辐射致癌相关的潜在特异性miRNA;另外关于其功能靶点目前国内外也未见系统报道。首先利用生物信息学预测技术分析探讨miRNA23在辐射致癌中的潜在靶点。预测结果显示：miR-23a和miR-23b可能靶向小鼠的细胞凋亡自杀相关蛋白FAS (Factor associated suicide)的3’UTR。接下来DLR(双荧光报告基因技术)实验发现,miR-23a和miR-23b可以明确抑制小鼠FAS 3’UTR报告基因活性,且miR-23a对FAS 3’UTR报告基因活性的抑制作用显著强于miR-23b。同样,流式细胞术的实验也发现了miR-23a和miR-23b可以显著抑制NIH3T3细胞的FAS蛋白的表达,且miR-23a对FAS蛋白的抑制作用也显著强于miR-23b。最后,我们通过对FAS 3’UTR多点突变的实验体系证明miR-23 a和niR-23b对FAS 3’UTR的抑制作用主要取决于其种子序列；而miR-23a所特有的与FAS 3’UTR互补的种子外序列可能增强了miR-23 a对FAS的抑制作用,这从位点特异性上部分解释了miR-23 a对FAS的抑制作用强于miR-23b的分子机制。这些实验结果表明,miRNA23可能通过靶向辐射致癌相关蛋白FAS的方式参与辐射致癌的发病过程。最后我们还发现,miR-23在辐射诱导T淋巴瘤小鼠血清中明显上调,以上结果说明miRNA-23可能是新的辐射致癌发病及诊断相关的重要的miRNA分子标签。2. miR-21对抑癌基因Big-h3的影响及其对TGF通路的调节作用miR-21是具有癌基因样作用的明星oncomiR并在辐射致癌组织中表达上调.我们首先进行了生物信息学和DLR等分子生物学实验,鉴定出了miR-21在辐射致癌组织中潜在的新靶点：TGF-β诱导性蛋白Big-h3。鉴于我们曾经发现辐射成瘤小鼠中重要细胞亚群Tregs、MDSC和TGFβ水平明显高于对照小鼠,但Big-h3在辐射致癌组织中表达却下调的实验结果,本实验试图从miRNA的途径探讨部分肿瘤高表达TGFβ却低表达Big-h3的部分机制。结果发现miR-21可以被TGFβ所诱导并反馈调节TGFβ通路；更有意思的是,miR-21既可以抑制TGFβ诱导Big-h3负反馈调节TGFβ通路,miR-21还可以在某些情况下诱导TGFβ分泌正反馈调节TGFβ通路,具有双向调节TGFβ通路的作用。此结果为部分临床肿瘤病人和荷瘤小鼠中,miR-21和TGFβ有高度正相关性的原因提供了新的解释。同时也为TGFβ同时具有抑癌基因和癌基因样的双向作用提供了新的实验支持。即一方面,TGFβ可以通过诱导抑癌基因Big-h3进而发挥其抑癌基因功能；另一方面,TGFβ在不同条件下还可以快速上调oncomiR miR-21表达进而负反馈抑制Big-h3并发挥其癌基因样作用。3.靶向小鼠P16基因的microRNA的探索p16是近年来发现的一个重要的抑癌基因并在辐射致癌组织中表达下调,亦有报道显示miR-24可以特异性的靶向人P16基因的3’UTR区；然而,我们却未能检索到国内外有关靶向小鼠P16基因的miRNA的相关报道。通过生物信息学预测结果显示：miR-126-5p是最可能特异性靶向小鼠p16 mRNA的miRNA。此外,miR-762, miR-693-5p,miR-760,miR-742,miR-127, miR-185和miR-193也具有小鼠p16 3’UTR区的互补序列。应用分子生物学实验发现,miR-126-5p以及miR762可以明确抑制小鼠P16 3’UTR报告基因活性和P16蛋白表达,其中miR-126-5p在体外靶向小鼠P16基因的作用最强：而特异性靶向人P16基因的miR-24对小鼠P16 3’UTR报告基因活性和P16蛋白表达均未见明确影响。最后我们发现miR-762是辐射成瘤中上调倍数最高的miRNA,而miR-126-5p在辐射成瘤组织与对照胸腺组织中相比没有显著差异。此结果提示miR-762很可能通过特异性抑制抑癌基因P16蛋白的方式参与辐射致癌的发病过程。4. miR-125和DNTT在辐射致癌过程中的作用我们应用免疫学细胞亚群的研究方法发现辐射致癌组织为一群CD4+CD8+ DNTT+的异常增生的T细胞亚群。在此基础上初步追踪了此异常DNTT阳性T细胞亚群的来源,发现DNTT阳性细胞亚群在辐射致癌发生过程中有非常独特的变化方式,且DNTT分子的抑制和启动均是辐射致癌发生的必要条件。同时支持本实验结果的另一文献佐证是,大量文献结果显示,DNTT在TCR基因重排过程中是必须的,并且DNTT在TCR重排后受抑制而消失同样也是T细胞发育的必要条件,然而有关DNTT的具体启动和消失机制目前十分不清楚,也是重要的科研盲点之一。为了探讨这一问题,我们从miRNA角度初步发现miR-125可以靶向小鼠DNTT并在辐射致癌过程中发挥着一定的作用。第三部分调控miRNA表达治疗肿瘤的初步探讨采用先体外后体内的实验方法探讨了部分miRNA对肿瘤细胞的杀伤效应。本部分实验中,我们针对辐射致癌组织中下调表达的部分miRNA(例如miR-200c、miR-486、miR-199、miR-193b、miR-143、miR-145、miR-125a/b、miR-31、miR-26a、miR-99a、miR-152、miR-29a和let-7e等),通过对NIH 3T3/A549/U87MG等细胞过表达以上部分miRNA的方法,探讨上调miR-200c、miR-486、miR-125b、miR-199b、miR-193b、miR-143、miR-145和let-7e等miRNA对细胞凋亡和增殖等功能的影响。结果显示,这些miRNA中有数条可以明确抑制肿瘤细胞的生长增殖,促进细胞凋亡,诱导细胞周期紊乱,增强DNA损伤Foci水平和抑制细胞的克隆形成率。进而从中筛选出4条体外杀伤肿瘤细胞效果较强且有一定创新性的miRNA,即：miR-200c、miR-486、miR-143和miR-125b。构建了过表达以上4条miRNA的腺病毒载体,计划对荷瘤裸鼠的体内抑瘤效果进行检测,部分体内实验正在进行中。第四部分miRNA在放射生物学其它方面意义的初步探索本部分研究主要初步探索miRNA与辐射敏感性、辐射防护、肿瘤辐射增敏及放射损伤生物标志物等方面的意义。初步结果有：miR-34a表达水平与正常细胞、组织及个体的电离辐射敏感性密切正相关；过表达miR-34a表达可以对肿瘤细胞U87产生显著的辐射增敏效果,而抑制miR-34a表达可以对正常细胞293起到比较较好的辐射防护的效应；且miR-34a在辐射损伤后12小时的小鼠血清中表达上调,提示其可能成为新的福射损伤相关的诊断指标。我们还对辐射致癌组织的辐射敏感性进行了初步探讨,发现辐射致癌组织对电离福射有一定的抗性,且其福射抗性与miR-34a无关,却与其高表达癌基因Ras有关；并且可特异性靶向Ras的miR-143和LET7也可以对U87MG细胞起到辐射增敏的效果。本课题的主要创新点：1.首次探讨miRNA在辐射致癌中的作用并获得了辐射致癌组织的总体niRNA表达谱,发现并验证了部分辐射致癌组织差异表达的miRNA。2.首次对部分辐射致癌相关miRNA的功能进行了初步研究；并首次克隆了多个辐射致癌相关重要基因的3’UTR区,构建了以上3’UTR报告基因载体和部分点突变3’UTR报告基因载体。3.首次鉴定出靶向小鼠FAS 3’UTR的miRNA miR-23,并对miR-23a和miR-23b对FAS的抑制作用差异性的分子机制进行探讨；首次鉴定出靶向小鼠P16 3’UTR的miRNA,并发现体外和体内靶向P163’UTR的miRNA差异；首次鉴定出靶向小鼠Big-h3 3’UTR的miRNA;首次鉴定出靶向小鼠B7H1 3’UTR的miRNA.4.首次对Tregs, MDSC和DC等重要细胞亚群在辐射致癌小鼠中的变化情况进行研究。5.首次发现miR-21可以正反两方向反馈调节TGFβ通路。6.首次发现DNTT分子的被抑制和启动均是辐射致癌发生的必要条件。7.首次探讨过表达部分miRNA对DNA损伤Foci水平的影响。8.首次构建部分过表达特定miRNA的腺病毒载体并应用于辐射致癌的体外、体内治疗和预防实验。9.首次探讨miRNA23和作为辐射致癌的血清学诊断指标。10.首次对辐射致癌组织的辐射敏感性及部分分子机制进行探讨。以上实验结果说明,microRNA在辐射致癌的发生中发挥着重要作用,在放射生物学其它方面也有重要的研究意义；microRNA可为辐射致癌诊断、预防和治疗的研究提供重要的新靶点、新方法、新思路。