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多糖作为石斛的主要活性成分之一,其纯化、分级、组成、结构及活性越来越受到人们的关注。为寻找与开发新的优质石斛资源,有效保护珍稀野生石斛资源,本文以传统的名贵药用植物,铁皮石斛(Dendrobium officinale)、金钗石斛(Dendrobium nobile)以及筛选出的高多糖含量的大苞鞘石斛(Dendrobiumwardianum)和春石斛杂交品种Dendrobium Second Love‘Tokimeki为主要研究对象,比较了它们茎段的粗多糖、精多糖和纯化多糖组分的结构特征及多种生物活性,主要研究结果如下: 1、高多糖和高生物碱含量石斛的筛选。以44种石斛原生种及春石斛杂交品种为材料,比较了它们的多糖和生物碱含量的差异,发现不同石斛种间差异较大。石斛原生种和春石斛杂交种的多糖含量分别在2.0~38.0%及9.4~27.6%之间,较高的几种分别为铁皮石斛(38.0%)≈苏瓣石斛(37.2%)>大苞鞘石斛(34.1%)>D.Himezakura‘Fujikka(27.6%)>D.Second Love‘Tokimeki(23.7%);而生物碱含量范围分别在0.005~0.638%及0.111~0.308%之间,较高的几种分别为报春石斛(0.638%)>兜唇石斛(0.586%)>玫瑰石斛(0.500%)>金钗石斛(0.415%)>束花石斛(0.337%)>D.Second Love‘Tokimeki(0.308%)。综合生物量、多糖和生物碱含量高低,最终筛选出原生种中的铁皮石斛、大苞鞘石斛、金钗石斛和杂交春石斛品种中的D.Second Love‘Tokimeki为后续试验材料。 2、比较了4种筛选石斛成熟季节多糖、氨基酸和微量元素含量的差异。(1)多糖含量:不同石斛在不同月份多糖含量存在差异,从野外采集的金钗石斛和大苞鞘石斛适宜在9-10月采收,而人工栽培的铁皮石斛和D.Second Love‘Tokimeki宜在12月份采收。多糖平均含量差异显著,以大苞鞘石斛(37.4%)最高,金钗石斛(12.0%)最低。(1)氨基酸含量:4种石斛均含有19种氨基酸和人体所必需的8种氨基酸,必需氨基酸总量以D.Second Love‘Tokimeki(0.175%)最高,铁皮石斛(0.094%)最低。金钗石斛和D.Second Love‘Tokimeki中Arg、Asp+Asn含量显著高于其他两种石斛。(2)微量元素含量:4种石斛微量元素含量存在差异,大苞鞘石斛富含Mg和Mn元素;金钗石斛富含Fe和B元素;D.SecondLove‘Tokimeki富含Ca和Zn元素。 3、比较了4种石斛的多糖特征。(1)用热水浸提法和醇沉法提取得到铁皮石斛、大苞鞘石斛、金钗石斛和D.Second Love‘Tokimeki的粗多糖(总称DCPs),分别命名为DOCP、DWCP、DNCP和DHCP;用Sevag去蛋白法进一步纯化得四种石斛精多糖(总称DPPs),分别命名为DOPP、DWPP、DNPP和DHPP;然后通过DEAE-Cellulose-52阴离子交换柱层析进行分级,分别得到4个水洗组分和4个0.3 mol·l-1NaCl洗组分,分别命名为DOPP-Ⅰ、DWPP-Ⅰ、DNPP-Ⅰ、DHPP-Ⅰ(总称DPPs-Ⅰ)和DOPP-Ⅱ、DWPP-Ⅱ、DNPP-Ⅱ、DHPP-Ⅱ(总称DPPs-Ⅱ),其中水洗脱部分为主要组分。(2)采用凝胶渗透色谱法(GPC)测得上述四种石斛DPPs和DPPs-Ⅰ的数均分子量和重均分子量,DPPs数均分子量和重均分子量的范围分别为14.0~25.5 KDa和24.1~76.9 KDa,以DWPP最小,DNPP和DHPP较大;DPPs-Ⅰ数均分子量和重均分子量的范围分别为4.55~13.1 KDa和12.0~52.3 KDa,以DNPP-Ⅰ最小,DHPP-Ⅰ和DOPP-Ⅰ较大。(3)采用GC-MS测得四种石斛DPPs和DPPs-Ⅰ的单糖组成均包括核糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖,其中含量较高的为甘露糖和葡萄糖。(4)红外光谱(FTIR)和核磁共振(NMR)分析了多糖构型,推知4种DPPs和DPPs-Ⅰ均含有α-和β-构型糖基,主要以吡喃环形式存在,其中葡萄糖主要以β-构型存在,两种主链结构相似,均含有Manp、GalAp和Glcp残基,部分残基被乙酰基取代。与DPPs相比,DPPs-Ⅰ具有更多的活性基团,其主链还包括Xylp残基,其中DOPP-Ⅰ和DWPP-Ⅰ主链上C2和C3位的O分别被乙酰基取代,各自形成活性基团。 4、比较了4种石斛多糖(DPs)在增强免疫力、降血压、降血糖、抗氧化及抗肿瘤方面的活性。(1)体内增强免疫力活性:石斛多糖纯度越高,增强免疫能力越强,以DPPs-Ⅰ效果最佳,小鼠胸腺指数、脾脏指数、小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力、迟发性超敏反应及血清抗体积数均显著提高,但四种DPPs-Ⅰ对增强小鼠体内免疫活性差异不显著。(2)体内降血压活性:4种DPs均对自发性高血压大鼠具有降血压的效果,其中以纯度较高的多糖组分DPPs-Ⅰ更佳,而4种DPPs-Ⅰ降血压的作用没有显著差异。(3)体内降血糖活性:多糖纯度越高或处理时间越长,降血糖效果越好,DPPs-Ⅰ在处理四周效果最佳,大苞鞘石斛和铁皮石斛降血糖效果显著优于金钗石斛和D.Second Love‘Tokimeki。(4)离体抗氧化活性:随着多糖纯度增强或浓度提高,抗氧化效果均提高,以1.2 mg·ml-1浓度下DPPs-Ⅰ处理效果最佳。4种DPPs-Ⅰ对DPpH·自由基的清除率均明显好于Vc,其中DOPP-Ⅰ和DWPP-Ⅰ的清除效果显著超过DNPP-Ⅰ和DHPP-Ⅰ;4种石斛多糖对·OH清除能力均好于Vc,而4种DPPs-Ⅰ无显著差异;4种DPs对O2-的清除率均显著低于Vc,4种DPPs-Ⅰ中,以DWPP-Ⅰ效果最佳,为46.8%,显著超过其他石斛多糖。(5)离体抗肿瘤细胞增殖活性:随着处理时间延长或浓度提高,抑制人肺腺癌SPC-A-1细胞增殖能力增强。4种DPs对SPC-A-1的抑制效果,均是DPPs-Ⅰ最佳,72h内,2 mg·ml-1浓度下,以DOPP-Ⅰ(44.1%)和DWPP-Ⅰ(43.9%)抑制率最佳,显著高于DNPP-Ⅰ(41.8%)和DHPP-Ⅰ(39.0%),后两者之间也具有显著差异。(6)大苞鞘石斛体内抗肿瘤活性:石斛多糖纯度越高,抗肿瘤效果越好,而DWCP联合P-CK处理具有增效作用,能显著抑制A549细胞增殖(23.4%),显著优于P-CK。