论文部分内容阅读
普通变形杆菌（Proteus.vulgaris）是一种食源性致病菌,广泛存在于自然界,存在于污水,土壤和垃圾中,也存在于人和动物的肠道中,是一种条件致病菌,容易污染肉类和蛋类等动物性食品,可导致胃肠炎,脑膜炎,败血症等疾病。传统检测变形杆菌属的方法操作繁琐,检测时间长,至少需要48-72h。不能满足食品中致病菌快速、灵敏的检测需要。因此需要研究变形杆菌的检测方法,为日常食品卫生检测提供快速检验的方法。环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification,简称LAMP）是由日本学者Notomi等人于2000发明的一种全新的核酸扩增方法。它采用能特异识别靶序列上6个位点的4条引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶（BstDNA polymerase）,在恒温条件（60～65℃）下,特异、高效、快速地进行核酸扩增。该技术在1h内能扩增出109靶序列拷贝,扩增产物是一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段的混合物。因其具有特异性强、灵敏度高、快速、准确和操作简便等优点因为其操作简单、快速、特异性高、成本低等优点,成为可以替代PCR的新的核酸扩增技术。本研究采用LAMP技术建立了快速检测普通变形杆菌的反应体系。该方法针对变形杆菌的特异基因atpD,用LAMP引物在线设计引物软件设计引物,在Bst DNA聚合酶作用下60℃恒温反应60min即可完成对变形杆菌DNA扩增过程。扩增产物以2.0%琼脂糖凝胶电泳检测。为确立了最佳反应条件,我们对Mg2+浓度、反应时间、反应温度、BST酶浓度等反应条件进行了优化,建立LAMP反应体系。LAMP反应的总反应体系为25μL,其中FIP和BIP为1.6μmol/L, F3和B3为0.2μmol/L,其它反应组分终浓度分别为:1.6 mmol/L dNTP, 2.5μL Bst酶缓冲液（20 mM Tris-HCl （pH8.8, 25℃）,10 mM KCl,10 mM （NH4）2SO4,2mM MgSO4, 0.1% .Triton X-100）, 0.4μL （8U） Bst大分子聚合酶,1.5μL目标DNA,纯水补足体积到25μL。将反应混合物在95℃加热5min后放置冰上冷却,在62℃孵育60min,然后在80℃加热10min终止反应。为评价该技术的特异性,我们使用设计的特异引物对11株菌分别进行了LAMP扩增,结果表明:只有变形杆菌为阳性结果,其它菌株均为阴性结果。采用FTA滤膜制备模板进行LAMP反应,其方法的灵敏度分别为6.4×102CFU/mL。利用LAMP技术直接检测人工污染的肉制品中的变形杆菌,其检出限为3.6×103CFU/g。实际检测了45份样品,用LAMP方法检测变形杆菌的检出率为88.9%,敏感性为100%,特异性为72.7%,符合率为93.3%,检出时间为1.5h。试验结果表明:本试验所建立的快速检测变形杆菌的LAMP检测方法具有较高的特异性和敏感性,能够满足变形杆菌快速检测的需要。