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本研究包括三部分内容:一、蜈蚣藻粗多糖(GFP)的抗血管生成作用研究;二、蜈蚣藻均一多糖GFP05、GFP08和GFP15的抗血管生成作用及机制研究;三、糖类化合物抗血管生成作用比较并初步探讨其构效关系。
应用MTT实验测定GFP对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)存活率的影响;用Matrigel检测GFP对HUVEC管腔形成的影响。结果表明GFP在5、10、20、50、100mg.L-1浓度下处理HUVEC 48h,细胞存活率与对照组比较没有显著性的变化;在100 mg.L-1时能显著性地抑制HUVEC的管腔形成。结论:GFP的抗肿瘤作用可能与其抑制肿瘤血管生成有关。
为明确蜈蚣藻粗多糖抗血管生成作用的物质基础,进一步研究了从蜈蚣藻粗多糖中分离得到的均一多糖GFP05、GFP08和GFP15的抗血管生成作用。HMEC-1的管腔形成实验表明GFP08和GFP15能显著性的抑制内皮细胞的管腔形成而GFP05则不能抑制其管腔形成。体内抗肿瘤实验表明GFP08和GFP15均能显著性的抑制小鼠S-180肉瘤的生长。应用MTT实验观察GFP08和GFP15对内皮细胞生存率和EGF,bFGF,VEGF诱导的HUVEC增殖的影响,结果表明GFP08和GFP15均不能显著性的抑制HUVEC的存活率和EGF、bFGF、VEGF诱导的HUVEC增殖,在高剂量时能轻微抑制HMEC-1的生存率。体外HUVEC管腔形成实验结果表明GFP08和GFP15均能显著性的抑制HUVEC的管腔形成,进一步细胞迁移实验发现GFP08和GFP15同样都能显著性的抑制20％FBS诱导的HUVEC的迁移。为研究GFP08和GFP15的抗血管生成机制,我们用酶谱法(Gelatin Zymography)测定了GFP08和GFP15对MMP-2和MMP-9酶活力的影响和用蛋白质免疫印迹法(westem-blot)检测了GFP08和GFP15对HUVEC的组织因子(TF)的蛋白表达的影响,结果表明GFP08和GFP15均能降低HUVEC的TF蛋白表达而对MMP-2和MMP-9酶活力没有显著性的影响。RT-PCR实验结果表明GFP08和GFP15均不能影响HUVEC的MMP-2的基因表达,GFP15也不能影响HUVEC的TF基因表达。GFP15DS、GFP15和GFP15S抗血管生成作用比较研究发现随着GFP15硫酸基含量的增加其抑制内皮细胞HUVEC管腔形成的能力也随之增强,对小鼠S-180肉瘤生长抑制率也极大提高。结论:GFP08和GFP15通过抑制肿瘤血管生成而抑制肿瘤生长,其机制都可能与降低TF蛋白的表达有关,而不是影响了MMP-2和MMP-9的酶活力。硫酸基团在GFP15的抗肿瘤作用发挥着重要作用。
通过对GFP05、GFP08、GFP15、UPP03、UPP04、OBP、HBP、葡糖糖(Glucose)、氨基葡萄糖(Glucosamine)、葡萄糖酸(Gluconic acid)、半乳糖(Galactose)、蔗糖(Sucrose),不同分子量葡聚糖如Dextran4.1w,Dextran58w和Blue-Dextran及它们的硫酸化产物抗血管生成作用比较研究来探讨糖类化合物的抗血管生成的构效关系。研究发现不同类型的多糖均随着硫酸基团含量的增加其抑制HUVEC管腔形成的能力得到极大增强,当分子量达到一定范围时多糖才具有抗血管生成作用而硫酸化的单糖不能抑制HUVEC的管腔形成。结论:糖类化合物只有当分子量与硫酸基团含量均达到一定范围时才具有抗血管生成作用。