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目的:为了解Irx5a基因对早期造血发育的影响,检测Irx5a对野生型斑马鱼基因表达量的变化;通过过表达Irx5a基因对造血发育表达相关的造血转录调控因子的表达情况影响。 方法:构建Irx5a-EGFP-pCS2+重组质粒,验证其正确性后,制备Irx5a-EGFP正义mRNA探针,通过显微注射技术导入野生型斑马鱼(Tuebingen)中,观察其在野生型斑马鱼胚胎中的表达情况。另外,以导入Irx5a-EGFP mRNA探针为实验组、EGFP mRNA探针为实验对照组、野生型斑马鱼为空白对照组,应用实时荧光定量PCR反应检测造血转录调控因子如 scl、lmo2、c-myb、runx-1、gata-1、pu.1在实验对照组及实验组及空白对照组中的表达水平。 结果:成功构建Irx5a-EGFP-pCS2+重组质粒;通过显微注射Irx5a-EGFP mRNA发现,在斑马鱼胚胎3hpf开始出现绿色荧光,在12hpf-18hpf时荧光表达量最强,其后荧光表达也逐渐减弱,至30hpf时荧光几乎消失,仅在斑马鱼的眼睛有极少量的表达;Irx5a-EGFP mRNA作为实验组,EGFP mRNA作为实验对照组,野生型斑马鱼作为空白对照组,三组相比较基因表达量相对定量中可知:lmo2、scl、runx-1、pu.1实验组表达量较另两组表达量低,三组均随着时相的增加基因表达量也增加,在12hpf中的表达量最高,以后逐渐减弱;但是c-myb、gata-1、中在18hpf中的表达量最高,以后逐渐减弱。 结论:在野生型斑马鱼 Irx5a基因于3hpf开始表达,多集中于神经系统,于12-18hpf表达量较高,以后逐渐减弱。在实时荧光定量 PCR实验结果中推测:在过表达Irx5a mRNA斑马鱼胚胎造血发育中,造血转录调控因子中是发挥着下调作用的,由此可知,Irx5a基因在斑马鱼原始造血、成体造血、红系、髓系重要的转录调控因子是发挥着抑制作用的。