论文部分内容阅读
目的：为了解Irx5a基因对早期造血发育的影响，检测Irx5a对野生型斑马鱼基因表达量的变化；通过过表达Irx5a基因对造血发育表达相关的造血转录调控因子的表达情况影响。 方法:构建Irx5a-EGFP-pCS2+重组质粒,验证其正确性后，制备Irx5a-EGFP正义mRNA探针,通过显微注射技术导入野生型斑马鱼（Tuebingen）中，观察其在野生型斑马鱼胚胎中的表达情况。另外，以导入Irx5a-EGFP mRNA探针为实验组、EGFP mRNA探针为实验对照组、野生型斑马鱼为空白对照组，应用实时荧光定量PCR反应检测造血转录调控因子如 scl、lmo2、c-myb、runx-1、gata-1、pu.1在实验对照组及实验组及空白对照组中的表达水平。 结果：成功构建Irx5a-EGFP-pCS2+重组质粒；通过显微注射Irx5a-EGFP mRNA发现，在斑马鱼胚胎3hpf开始出现绿色荧光，在12hpf-18hpf时荧光表达量最强，其后荧光表达也逐渐减弱，至30hpf时荧光几乎消失，仅在斑马鱼的眼睛有极少量的表达；Irx5a-EGFP mRNA作为实验组，EGFP mRNA作为实验对照组，野生型斑马鱼作为空白对照组，三组相比较基因表达量相对定量中可知：lmo2、scl、runx-1、pu.1实验组表达量较另两组表达量低，三组均随着时相的增加基因表达量也增加，在12hpf中的表达量最高，以后逐渐减弱；但是c-myb、gata-1、中在18hpf中的表达量最高，以后逐渐减弱。 结论：在野生型斑马鱼 Irx5a基因于3hpf开始表达，多集中于神经系统，于12-18hpf表达量较高，以后逐渐减弱。在实时荧光定量 PCR实验结果中推测：在过表达Irx5a mRNA斑马鱼胚胎造血发育中，造血转录调控因子中是发挥着下调作用的，由此可知，Irx5a基因在斑马鱼原始造血、成体造血、红系、髓系重要的转录调控因子是发挥着抑制作用的。