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背景与目的 各种致病因子均可导致肝脏的急慢性炎症。长期的肝组织炎症状态致使肝纤维化的发生,而这将使肝癌的患病风险增加,对健康产生严重威胁。天然药物黄芪的有效成分为黄芪甲苷（AS-Ⅳ）,有报道指出AS-Ⅳ具有抗炎、抗氧化等生物活性,并可通过调节Nrf2/HO-1和TGF-b1/Smad3途径抑制肝纤维化发展。Nrf2在受到氧化应激等刺激后,磷酸化后入核,刺激下游抗氧化基因的表达,产生肝保护作用;Smad3是TGF-b1/Smad3信号通路的主要信号分子,其区域磷酸化可以调控肝疾病的进展。前期研究中发现,在肝纤维化疾病中Nrf2/HO-1与TGF-b1/Smad3通路存在相关性。本研究将通过体内外实验验证AS-Ⅳ的抗肝纤维化作用,明确Nrf2基因敲除对黄芪甲苷经由p Smad3C/3L抗肝纤维化作用机制的影响。方法1.体外实验验证AS-Ⅳ抑制TGF-b1刺激HSC-T6细胞增殖、迁移并抑制ROS水平复苏并培养HSC-T6到指数增长期,设立以下实验组:溶媒对照组、TGF-b1刺激组、AS-Ⅳ（5mM）+TGF-b1刺激组、AS-Ⅳ（10mM）+TGF-b1刺激组与AS-Ⅳ（20mM）+TGF-b1刺激组,进行MTT、细胞划痕,ROS水平测定。2.利用C57BL/6小鼠分析AS-Ⅳ抗DEN/CCl4/C2H5OH诱导的肝纤维化作用及涉及的Nrf2/HO-1通路作用机制选购洁净等级是SPF级,品系为C57BL/6,状态良好的雄性6周龄小鼠,所需数量36,体重在20-23g之间;均匀地随机分6个小组,6只/组:正常对照组（Control）、模型组（Model）、黄芪甲苷低、中、高剂量组（剂量分别是20、40、80mg/kg/d;ig）与阳性药物秋水仙碱对照组（Col）（0.1mg/kg/d;ig）。肝纤维化模型建立方法:腹腔注射DEN 100 mg/Kg（第1-2周,在每周相同时间点各注射一次）;20%CCl4的橄榄油溶液0.05ml/10g（第3-7周,2次/周,ig）;10%浓度酒精代水饮（第3-12周,隔日更换）;20%CCl4的橄榄油溶液0.06ml/10g（第8-12周,2次/周,ig）。从造模第一天到最后一天,每天向秋水仙碱组和ASⅣ各剂量组,灌胃不同剂量的对应药物。向对照与模型组用灌胃的方式给对应的溶媒,以上造模与给药都持续进行到12周末,然后取材。对肝脏进行肉眼的初步观察、苏木精-伊红（HE）染色用以观察病理学改变,用Masson染色检测纤维化程度变化。Western-blot检测Nrf2、p Nrf2、HO-1、NQO1蛋白水平,免疫荧光染色检测p Nrf2表达和分布情况,并进行p Smad3C/3L与p Nrf2的相关性分析。3.建立Nrf2基因敲除小鼠诱导肝纤维化模型及AS-Ⅳ的干预并探究其对TGF-b1/Smad3通路的影响将成功构建的Nrf2基因敲除小鼠送至SPF级实验室,开展小鼠的饲养和扩繁工作。基因型鉴定筛选出6周龄纯合子（HO）及C57BL/6小鼠（WT）各18只并随机进行分组,实验分组情况如下:WT-对照组、HO-对照组、WT-模型组、HO-模型组、WT-AS-Ⅳ组和HO-AS-Ⅳ组,每个组别准备6只小鼠。除对照组外,其余组小鼠予以建立DEN/CCl4/C2H5OH诱发的肝纤维化模型,治疗组小鼠AS-Ⅳ的给予量为40 mg/kg/d,其余小鼠给予溶媒。取材时间位于造模起的第12周末,样本包括肝组织样本和血清样本,肝组织取一部分-80℃冰箱冻存,另一部分常规多聚甲醛固定、石蜡包埋和切片、HE/Masson染色;血清样本按照ALT/AST/ALP/TGF-b1/HA试剂盒说明书要求进行检测,取肝组织匀浆按试剂盒说明书测定SOD与MDA,Western-blot检测Nrf2、p Nrf2、TGF-b1、p Smad3C/L、a-肌动蛋白（a-SMA）、p21、纤溶酶原激活剂抑制物-1（PAI-1）蛋白水平,免疫荧光检测p Nrf2、p Smad3C/L表达和分布情况,以探究AS-Ⅳ抗DEN/CCl4/C2H5OH诱导的Nrf2基因敲除小鼠肝纤维化的作用机制。结果1.AS-Ⅳ抑制TGF-b1刺激的HSC-T6细胞的增殖和迁移并降低ROS水平MTT、细胞划痕与活性氧的测定结果显示AS-Ⅳ能显著抑制TGF-b1刺激的HSC-T6细胞的增殖和迁移,并降低ROS水平。2.AS-Ⅳ增加肝纤维化小鼠Nrf2/HO-1通路的蛋白水平AS-Ⅳ显著降低DEN/CCl4/C2H5OH诱导的肝纤维化程度。Western-blot结果提示AS-Ⅳ显著促进p Nrf2、HO-1和NQO1肝脏中水平。免疫荧光染色结果显示ASⅣ显著促进p Nrf2表达。相关性分析显示p Smad3C/3L和p Nrf2的表达在体内有显著相关性。3.Nrf2基因敲除削弱AS-Ⅳ对DEN/CCl4/C2H5OH诱导的小鼠肝纤维化的治疗作用肝指数结果显示Nrf2敲除小鼠较野生型小鼠肝重明显降低,结合取材时观察到的肝脏缩小,提示Nrf2敲除可能导致肝脏萎缩。野生型模型组AST、ALT、ALP、MDA水平升高,给药组降低;SOD水平降低,给药后升高。而Nrf2敲除小鼠模型组AST、ALT、ALP、MDA水平较野生型模型组高,且给药后无明显降低;Nrf2敲除小鼠模型组SOD水平明显降低,给药后无明显升高。WT模型组HE与Masson结果表现出明显的胶原沉积,而WT给药组胶原显著减少;Nrf2敲除小鼠模型组纤维沉积较野生型模型组显著增多,且基因敲除给药组纤维沉积并未显著减少。ELISA检测到HA水平明显升高,蛋白水平检测到a-SMA表达也明显升高;并且对比两种小鼠,以上指标均显示HO小鼠的病变程度较高。WT给药组小鼠的病变改善突出,而HO给药组小鼠病变改善不明显。4.Nrf2基因敲除抑制AS-Ⅳ抗肝纤维化过程中TGF-b1蛋白的下调肝纤维化造模12周后,两种小鼠血清和肝组织中的TGF-b1蛋白水平明显升高,并且HO小鼠TGF-β1蛋白升高更为突出;使用AS-Ⅳ后,WT小鼠的TGF-b1水平显著降低,HO小鼠的变化不明显。5.Nrf2基因敲除抑制AS-Ⅳ抗肝纤维化过程中p Smad3C和p21蛋白的上调模型组小鼠肝组织中p Smad3C和p21水平升高,但HO小鼠模型组p Smad3C和p21水平升高程度较野生型低。野生型AS-Ⅳ治疗组水平较对应模型组显著升高,而纯合子AS-Ⅳ组较对应模型组升高不明显。6.Nrf2基因敲除抑制AS-Ⅳ抗肝纤维化过程中p Smad3L和PAI-1蛋白的下调模型组小鼠肝组织中p Smad3L和PAI-1水平升高,且HO小鼠模型组p Smad3L和PAI-1水平较野生型模型组更高。野生型AS-Ⅳ治疗组水平较对应模型组显著降低,而纯合子AS-Ⅳ组较对应模型组降低不明显。结论1.AS-Ⅳ经由Nrf2/HO-1通路发挥抗肝纤维化作用,Nrf2基因敲除减弱AS-Ⅳ抗肝纤维化能力。2.Nrf2基因敲除抑制AS-Ⅳ抗小鼠肝纤维化过程中p Smad3C/p21信号通路的上调。3.Nrf2基因敲除抑制AS-Ⅳ抗小鼠肝纤维化过程中p Smad3L/PAI-1信号通路的下调。