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背景肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是病死率较高的恶性肿瘤之一。HCC由各种复杂的危害因素引发,多形成于慢性肝病或肝硬化的基础上。目前,针对肝细胞癌的治疗有限,大多数患者总体预后较差。因此,仍需进一步探索更多针对HCC的防治策略。近年来,研究表明一些中药单体对癌细胞增殖、转移及癌组织血管生成具有显著的抑制作用,且具有无副作用及不良反应等优势。黄芪甲苷（Astragaloside IV,AS-IV）是中药黄芪的单体,在一些恶性肿瘤中表现出良好的抗癌作用。目前,仅有研究表明AS-IV对肝癌细胞和荷瘤小鼠具有一定的抑制作用。然而,AS-IV对DEN/CCl4/C2H5OH诱导的C57BL/6J小鼠肝癌发生发展的影响仍不明确。本课题组前期研究表明复方芪参在体内外通过调控p Smad3C/L通路抑制肝细胞癌进展,而AS-IV作为复方芪参的有效成分之一是否也通过调控p Smad3C/L通路发挥肝癌抑制作用仍有待探究。另外,有研究发现,AS-IV通过增加Nrf2的转录激活,并增强HO-1的表达减轻了对乙酰氨基酚诱导的小鼠肝毒性。那么,AS-IV抗HCC作用是否涉及调控Nrf2/HO-1信号通路?带着这些疑问,本研究使用DEN/CCl4/C2H5OH诱导的C57BL/6J小鼠肝癌模型、TGF-b1刺激的人肝癌Hu H-7细胞,从体内、外角度观察AS-IV对HCC的影响,并对其作用机制进行探究。目的1.明确AS-IV对DEN/CCl4/C2H5OH诱导的C57BL/6J小鼠肝癌的影响,并探究AS-IV作用机制是否与调控p Smad3C/L及Nrf2/HO-1信号通路有关。2.明确AS-IV对TGF-b1刺激的Hu H-7细胞增殖、迁移、侵袭的影响,并探究AS-IV作用机制是否与调控p Smad3C/L及Nrf2/HO-1信号通路有关。方法1.AS-IV对DEN/CCl4/C2H5OH诱导的C57BL/6J小鼠肝癌的影响及机制探究分组如下:对照组、模型组、AS-IV（20 mg/kg）组、AS-IV（40 mg/kg）组、AS-IV（80 mg/kg）组、Colchicine（0.1 mg/kg）组。除对照组外,其余组采用DEN/CCl4/C2H5OH联合诱导小鼠肝癌。AS-IV各剂量组和Colchicine组每天灌胃给予相应剂量的药物,其余组给予相应溶媒。于第20周末进行小鼠取材,收集小鼠血清和肝组织样本。用试剂盒检测ALT、AST、SOD、MDA、TGF-β1水平;HE染色察看组织病理学变化;Western blot检测GST-P1、AFP、TGF-β1、p Smad3C、p21、p Smad3L、c-Myc、Nrf2/p Nrf、HO-1蛋白水平;免疫荧光法检测p Smad3C/L的表达。2.AS-IV对TGF-β1刺激的Hu H-7细胞增殖、迁移、侵袭的影响及机制探究分组如下:对照组、TGF-β1组、TGF-β1+AS-IV（5μM）组、TGF-β1+AS-IV（10μM）组、TGF-β1+AS-IV（20μM）组。除对照组外,其余组采用TGF-β1（9或40 p M）刺激Hu H-7细胞。AS-IV各浓度组加入相应终浓度的药物处理24 h,其余组加入等体积溶媒。CCK-8法、细胞划痕法、Transwell小室法分别检测细胞增殖、迁移、侵袭能力;DCFH-DA法检测细胞内ROS水平;Western blot检测p Smad3C、p21、p Smad3L、c-Myc、Nrf2/p Nrf2、HO-1蛋白水平;细胞免疫荧光法检测p Smad3C、Nrf2的表达和分布。结果1.AS-IV减缓DEN/CCl4/C2H5OH诱导的小鼠肝癌病理进程观察各组小鼠肝脏,模型组可见肿瘤病灶和结节斑块,AS-IV给药组肿瘤病灶和结节斑块数量有所减少。HE染色显示,模型组小鼠肝细胞排列紊乱,可见蓝染明显、大小不一的异型细胞核,大范围可见肝癌细胞病灶区;与模型组相比,AS-IV给药组肝组织病变程度有所改善。检测肝癌标志蛋白AFP、GST-P1发现,与对照组相比较,DEN/CCl4/C2H5OH诱导小鼠肝组织中AFP、GST-P1蛋白水平显著升高;而随着AS-IV给药剂量的增加,小鼠肝组织中AFP、GST-P1蛋白水平逐渐降低,进一步验证了AS-IV对小鼠肝癌的抑制作用。另外,肝功能指标（ALT、AST）和氧化应激损伤指标（SOD、MDA）检测结果表明,DEN/CCl4/C2H5OH诱导小鼠出现了显著的肝功能损伤和氧化应激损伤;而AS-IV给药后,小鼠肝功能损伤和氧化应激损伤程度逐渐得到减轻。2.AS-IV调控p Smad3C/L通路相关蛋白减缓小鼠肝癌病理进程2.1 AS-IV降低肝癌小鼠血清和肝组织中TGF-β1水平通过ELISA检测试剂盒和Western blot法分别测定各组小鼠血清和肝组织中TGF-β1水平,结果显示,与对照组相比,模型组小鼠血清和肝组织中TGF-β1水平均显著升高,而给予不同剂量的AS-IV（20、40、80 mg/kg）后,小鼠血清和肝组织中TGF-β1水平逐渐降低。提示AS-IV能够降低肝癌小鼠血清和肝组织中TGF-β1水平。2.2 AS-IV对肝癌小鼠肝组织中p Smad3C和p21蛋白表达的影响Western blot检测结果表明,与模型组相比,AS-IV治疗组小鼠肝组织中p Smad3C、p21蛋白表达增强,其中AS-IV（40、80 mg/kg）组p Smad3C、p21蛋白的表达显著增加。上述结果表明,AS-IV促进了小鼠肝组织p Smad3C、p21蛋白表达。免疫荧光检测结果进一步表明,AS-IV促进了小鼠肝组织中p Smad3C蛋白的表达。2.3 AS-IV对肝癌小鼠肝组织中p Smad3L和c-Myc蛋白表达的影响Western blot检测结果表明,与模型组相比,AS-IV治疗组小鼠肝组织中p Smad3L、c-Myc蛋白表达降低,AS-IV（80 mg/kg）组p Smad3L、c-Myc蛋白水平降低最明显。上述结果表明,AS-IV降低了小鼠肝组织p Smad3L、c-Myc蛋白表达。免疫荧光检测结果进一步显示,AS-IV干预后,小鼠肝组织中p Smad3L蛋白表达减弱。3.AS-IV对肝癌小鼠肝组织中Nrf2/HO-1通路相关蛋白表达的影响Western blot检测结果表明,与模型组相比,AS-IV（40、80 mg/kg）剂量组中p Nrf2的蛋白水平显著升高。同时,AS-IV给药处理也增强了Nrf2的下游靶蛋白HO-1的表达,且AS-IV（80 mg/kg）组具有显著的统计学差异（P＜0.01）。上述结果提示,AS-IV上调了小鼠肝组织中Nrf2/HO-1通路相关蛋白的表达。4.AS-IV抑制TGF-β1刺激的Hu H-7细胞的增殖、迁移、侵袭细胞表型实验（CCK-8法、细胞划痕法、Transwell小室法）结果显示,与对照组相比,TGF-β1组Hu H-7细胞的增殖、迁移、侵袭能力显著增强,而AS-IV（5、10和20μM）预处理显著降低了Hu H-7细胞的增殖、迁移、侵袭。提示AS-IV能够抑制TGF-β1刺激的Hu H-7细胞的增殖、迁移、侵袭能力,发挥体外抗HCC作用。5.AS-IV抑制TGF-β1刺激的Hu H-7细胞的ROS的产生DCFH-DA探针法结果显示,与对照组相比,TGF-β1组Hu H-7细胞ROS水平显著增高,提示TGF-β1促进了Hu H-7细胞内ROS的产生;而随着AS-IV给药浓度的增加,Hu H-7细胞ROS水平显著降低且呈浓度依赖性,提示AS-IV能够抑制TGF-β1刺激的Hu H-7细胞内ROS的产生,减轻氧化应激损伤。6.AS-IV调控TGF-β1刺激的Hu H-7细胞的p Smad3C/L通路6.1 AS-IV对TGF-β1刺激的Hu H-7细胞中p Smad3C和p21蛋白表达的影响Western blot检测结果表明,与对照组相比,TGF-β1刺激显著促进了p Smad3C蛋白的表达,而AS-IV处理进一步增加了p Smad3C蛋白水平。此外,p21蛋白水平也随着AS-IV的作用而显著升高。上述结果表明,AS-IV上调了TGF-β1刺激的Hu H-7细胞中的p Smad3C、p21蛋白表达。细胞免疫荧光实验结果进一步显示,AS-IV增加了p Smad3C蛋白的核表达。6.2 AS-IV对TGF-β1刺激的Hu H-7细胞中p Smad3L、c-Myc蛋白表达的影响Western blot检测结果表明,与对照组相比,TGF-β1刺激显著促进了p Smad3L的蛋白表达。而AS-IV处理后,p Smad3L及其下游靶蛋白c-Myc的水平降低,其中TGF-β1+AS-IV（10μM）组、TGF-β1+AS-IV（20μM）组,具有显著的统计学差异。提示AS-IV抑制了TGF-β1刺激的Hu H-7细胞中的p Smad3L、c-Myc蛋白的表达。7.AS-IV对TGF-β1刺激的Hu H-7细胞中Nrf2/HO-1通路相关蛋白表达的影响Western blot检测结果表明,与对照组相比,TGF-β1组中Nrf2和p Nrf2的水平较低。然而,随着AS-IV的共同处理,Nrf2和p Nrf2的蛋白水平以浓度依赖性方式逐渐增加。同时,在TGF-β1诱导的Hu H-7细胞中,AS-IV预处理也提高了Nrf2的下游靶蛋白HO-1的表达。这表明AS-IV活化了TGF-β1刺激的Hu H-7细胞中Nrf2/HO-1通路。细胞免疫荧光实验结果进一步显示,AS-IV剂量依赖性增加了Nrf2蛋白的核表达。结论1.AS-IV抑制了DEN/CCl4/C2H5OH诱导的C57BL/6J小鼠肝癌的发生发展,且AS-IV可能通过调控p Smad3C/L及Nrf2/HO-1信号通路发挥抗小鼠肝癌作用。2.AS-IV抑制了TGF-b1刺激的Hu H-7细胞的增殖、迁移、侵袭,且AS-IV可能通过调控p Smad3C/L及Nrf2/HO-1信号通路发挥体外抗肝细胞癌作用。