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胃癌(Gastric carcinoma)是常见的恶性肿瘤之一，具有较强的侵袭性和危害性，是造成全世界肿瘤相关死亡的第二大常见疾病。近年来，随着科技手段的不断发展，对胃癌的发病机理和诱因取得了更深入的认识，胃癌的发病率己呈现逐年下降的趋势，但因早期胃癌发病隐匿，大部分胃癌患者明确诊断时己属进展期胃癌，因此治疗效果差，与早期胃癌相比五年生存率明显降低，预后不良。目前胃癌治疗手段仍以手术治疗为主，联合术前术后辅助化疗等传统治疗方式。虽然新兴的免疫治疗和单克隆抗体靶向治疗也取得了明确的临床效果，但仍然存在精准性不足，长期使用仍然存在耐药性问题，因此寻求更为精准有效的治疗手段是目前胃癌治疗的研究热点。Polo-like kinase1(PLK1)属于丝氨酸/苏氨酸激酶，它参与了G2期向M期的过渡以及晚期G2/早前期纺锤体形成和中心体功能成熟的过程。PLK1在包括胃癌在内的多种癌症中过表达，降低PLK1表达水平不仅可以诱导G2/M期阻滞和细胞凋亡从而抑制癌细胞增殖，还可以增强肿瘤细胞对化疗及放疗的敏感性，并减弱其在致癌转化，肿瘤起始和存活，上皮-间质转化(EMT)诱导和肿瘤迁移和侵袭中的作用。因此，下调PLK1在细胞内的表达水平有望成为胃癌的有效治疗靶点。与ATP竞争性或多肽类小分子抑制剂相比而言，基于小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)的RNA干扰治疗手段具有特异性高，毒副作用小等不可替代的优势，因此在基因治疗和新型药物开发领域受到广泛关注。siRNA是一条长约21-25nt的双链RNA，与胞内蛋白形成RISC复合体，引导链通过RISC复合体与互补的mRNA序列配对，结合后可通过RNase介导的mRNA降解诱导mRNA沉默从而抑制蛋白的表达。但siRNA本身带负电且不稳定，存在着细胞穿透性差和易被核酸酶降解等问题，因此寻求一种稳定高效的基因递送系统才能实现核酸的成功入胞和稳定存在并发挥基因沉默功效。
目前针对siRNA的递送系统主要分为病毒和非病毒系统两类，与病毒载体相比，非病毒载体具有免疫原性低、生物相容性好、基因负载量高、可修饰性强、载体毒性小等优点，可以有效克服病毒载体的诸多局限性。其中阳离子聚合物因其表面正电性，具有较高的负载效率，较低的生物毒性和易修饰性而被普遍应用于药物递送体系。聚乙烯亚胺(PEI)是阳离子聚合物中被广泛应用的一种，具有如下优良特性：PEI表面具有较高的阳离子电荷密度，可以与带负电的核酸分子通过静电相互作用进行组装，并且每隔两个碳原子都会存在质子化的氨基氮原子，使得聚合物具有“质子海绵效应”从而提高复合物的内涵体逃逸能力；其次，支链PEI(BPEI)的分枝度高且具有叔氨基使载体更稳定且转染效率更高，目前很多设计复杂的基因载体均以PEI作为核心；此外，PEI的表面易于修饰多种配体分子使其成为性能更加稳定的多功能递送载体。由此可见，PEI因其良好的理化性质使其有望在基因递送中发挥更大潜力。尽管PEI具有较高的转染效率，但未经修饰的PEI仍存在细胞毒性大，血液相容性低和缺乏生物降解性等缺点，使其在临床应用上受到极大的限制。因此，通过不同分子对PEI表面进行修饰，制造具有靶向性的低毒高效的改性PEI递送体系对实现基因药物的精准递送具有重大意义。
本文中利用叶酸(FA)和N-乙酰-L-亮氨酸(N-Ac-L-Leu)修饰了聚乙烯亚胺(PEI)载体，成功构建了对胃癌SGC-7901细胞系具有特异靶向性的纳米复合物FA-N-Ac-L-Leu-PEI(NPF)。FA可以选择性结合大多数人类癌症中过表达的FA受体，基于特定的识别，FA的修饰己被证明可以增强siRNA对FA受体过度表达的细胞系的体内外沉默，N-Ac-L-Leu可降低PEI表面的正电荷密度并稳定复合物，具有更好的转染效果和更低的细胞毒性。NPF载体可通过表面带有的正电荷与带负电的PLK1siRNA结合，因此通过合成的纳米载体对PLK1siRNA进行递送，形成NPF/siPLK1纳米复合物，并通过一系列实验评价了载体的基因负载能力和靶向性以及PLK1沉默对胃癌的作用。首先，通过核磁共振，红外光谱和GPC表征了NPF载体的成功合成，每个PEI分子可以成功接枝81个N-Ac-L-Leu和16个叶酸，通过凝胶阻滞实验检测到NPF与siPLK1可以在质量比为3.0时有效地组装成稳定纳米颗粒，并具有出色的缩合和保护核酸免受核酸酶降解的能力，并通过TEM电镜拍照和粒径电位测量发现NPF/siRNA可以形成粒径均一的球型复合物。接下来，通过流式细胞仪和显微镜拍照评估了NPF载体对siRNA及EGFP质粒的转染能力以及FA介导的靶向递送能力，NPF/siPLK1入胞效率明显高于未修饰FA的载体。通过实时定量PCR和western blotting检测NPF介导的siPLK1转染可以有效沉默基因或蛋白质的表达水平。通过MTT和集落形成实验发现经NPF介导的siPLK1转染在体外显示出显著的抗增殖活性，主要是通过诱导细胞周期阻滞和凋亡所致，肿瘤细胞在G2期的阻滞率为45%，凋亡率为28.3%，通过对细胞凋亡相关蛋白和线粒体膜电位的检测发现siPLK1可以降低内源性凋亡途径相关蛋白pro-caspase3和9蛋白的表达且膜电位发生下降说明siPLK1诱导的细胞凋亡是通过内源性线粒体途径发生的。划痕实验transwell分析证明了PLK1沉默降低了细胞的迁移和侵袭能力，且与迁移和侵袭能力有关的Notch-1蛋白的表达量也明显被抑制。
综上所述，以叶酸受体高表达的SGC-7901细胞系为模型，以FA和N-Ac-L-Leu修饰的PEI靶向递送siRNA能有效抑制胃癌细胞的增殖和迁移，诱导细胞的凋亡和周期阻滞。通过本研究证实了PLK1基因可作为胃癌治疗的潜在靶点，且利用靶向载体进行基因递送可作为有希望的临床胃癌治疗策略。
目前针对siRNA的递送系统主要分为病毒和非病毒系统两类，与病毒载体相比，非病毒载体具有免疫原性低、生物相容性好、基因负载量高、可修饰性强、载体毒性小等优点，可以有效克服病毒载体的诸多局限性。其中阳离子聚合物因其表面正电性，具有较高的负载效率，较低的生物毒性和易修饰性而被普遍应用于药物递送体系。聚乙烯亚胺(PEI)是阳离子聚合物中被广泛应用的一种，具有如下优良特性：PEI表面具有较高的阳离子电荷密度，可以与带负电的核酸分子通过静电相互作用进行组装，并且每隔两个碳原子都会存在质子化的氨基氮原子，使得聚合物具有“质子海绵效应”从而提高复合物的内涵体逃逸能力；其次，支链PEI(BPEI)的分枝度高且具有叔氨基使载体更稳定且转染效率更高，目前很多设计复杂的基因载体均以PEI作为核心；此外，PEI的表面易于修饰多种配体分子使其成为性能更加稳定的多功能递送载体。由此可见，PEI因其良好的理化性质使其有望在基因递送中发挥更大潜力。尽管PEI具有较高的转染效率，但未经修饰的PEI仍存在细胞毒性大，血液相容性低和缺乏生物降解性等缺点，使其在临床应用上受到极大的限制。因此，通过不同分子对PEI表面进行修饰，制造具有靶向性的低毒高效的改性PEI递送体系对实现基因药物的精准递送具有重大意义。
本文中利用叶酸(FA)和N-乙酰-L-亮氨酸(N-Ac-L-Leu)修饰了聚乙烯亚胺(PEI)载体，成功构建了对胃癌SGC-7901细胞系具有特异靶向性的纳米复合物FA-N-Ac-L-Leu-PEI(NPF)。FA可以选择性结合大多数人类癌症中过表达的FA受体，基于特定的识别，FA的修饰己被证明可以增强siRNA对FA受体过度表达的细胞系的体内外沉默，N-Ac-L-Leu可降低PEI表面的正电荷密度并稳定复合物，具有更好的转染效果和更低的细胞毒性。NPF载体可通过表面带有的正电荷与带负电的PLK1siRNA结合，因此通过合成的纳米载体对PLK1siRNA进行递送，形成NPF/siPLK1纳米复合物，并通过一系列实验评价了载体的基因负载能力和靶向性以及PLK1沉默对胃癌的作用。首先，通过核磁共振，红外光谱和GPC表征了NPF载体的成功合成，每个PEI分子可以成功接枝81个N-Ac-L-Leu和16个叶酸，通过凝胶阻滞实验检测到NPF与siPLK1可以在质量比为3.0时有效地组装成稳定纳米颗粒，并具有出色的缩合和保护核酸免受核酸酶降解的能力，并通过TEM电镜拍照和粒径电位测量发现NPF/siRNA可以形成粒径均一的球型复合物。接下来，通过流式细胞仪和显微镜拍照评估了NPF载体对siRNA及EGFP质粒的转染能力以及FA介导的靶向递送能力，NPF/siPLK1入胞效率明显高于未修饰FA的载体。通过实时定量PCR和western blotting检测NPF介导的siPLK1转染可以有效沉默基因或蛋白质的表达水平。通过MTT和集落形成实验发现经NPF介导的siPLK1转染在体外显示出显著的抗增殖活性，主要是通过诱导细胞周期阻滞和凋亡所致，肿瘤细胞在G2期的阻滞率为45%，凋亡率为28.3%，通过对细胞凋亡相关蛋白和线粒体膜电位的检测发现siPLK1可以降低内源性凋亡途径相关蛋白pro-caspase3和9蛋白的表达且膜电位发生下降说明siPLK1诱导的细胞凋亡是通过内源性线粒体途径发生的。划痕实验transwell分析证明了PLK1沉默降低了细胞的迁移和侵袭能力，且与迁移和侵袭能力有关的Notch-1蛋白的表达量也明显被抑制。
综上所述，以叶酸受体高表达的SGC-7901细胞系为模型，以FA和N-Ac-L-Leu修饰的PEI靶向递送siRNA能有效抑制胃癌细胞的增殖和迁移，诱导细胞的凋亡和周期阻滞。通过本研究证实了PLK1基因可作为胃癌治疗的潜在靶点，且利用靶向载体进行基因递送可作为有希望的临床胃癌治疗策略。