干细胞移植在组织修复应用和研究中已经得到广泛应用,但由于病理微环境与正常生理的差异,如何改善移植区域微环境使其更有利于干细胞的生长分化一直是干细胞相关产品开发和基础研究的热点。铁超载可因膳食或出血性疾病等原因导致局部的铁离子浓度过高,进而会因氧化应激而产生组织损伤,而在铁超载区域进行干细胞移植也会影响干细胞的生长分化。本课题基于脑出血术后铁超载的环境下,构建了一种双层角蛋白神经支架作为干细胞移植载体。外层支架为载米诺环素的低分子量角蛋白,目的是为了螯合脑组织中过载的铁离子从而改善局部脑环境,并且低分子量角蛋白还具有快速降解特性;而内层支架借助高分子量角蛋白为载体,同时包埋骨髓间充质干细胞和载生长因子的PLGA纳米粒,高分子量角蛋白降解较慢,可支撑干细胞在铁超载区域的生长分化。双层角蛋白支架设计可为脑出血后干细胞治疗提供一种新思路和治疗理念,也对铁超载区域的干细胞治疗提供实验基础。本课题的主要研究内容和相应结论如下所示:(1)TGA作为还原剂,从人发中提取得到角蛋白。利用超滤平板膜设备对所得到的角蛋白进行分子量的划分。SDS-PAGE显示共得到高分子量角蛋白(>50 kDa)和低分子量角蛋白(30-50 kDa)。角蛋白神经支架内层需要较长时间支撑干细胞生长分化,通过流变性能实验确定了内层凝胶为高分子量角蛋白组成,浓度为35%。外层凝胶选择低分子量角蛋白,其浓度通过铁离子吸附实验确定为45%。通过SEM对上述两种浓度的角蛋白凝胶进行观察,结果表明均具有高度的空隙性。体外进行降解实验表明内外两层凝胶具有不同的降解速率。通过分层注射体外制备双层角蛋白神经支架并观察,表明双层结构完整均一。同时利用双重乳化法制备了载生长因子EGF/b-FGF的PLGA纳米粒,体外药物释放实验表明PLGA纳米粒具有缓慢释放生长因子的效果。(2)角蛋白神经支架构建完毕后,于细胞水平上对其初步生物学性能进行评价。利用全骨髓法提取骨髓间充质干细胞。研究了双层神经支架的干细胞毒性,考察了在细胞水平铁超载环境下,载药角蛋白凝胶对骨髓间充质干细胞生长分化的保护作用。结果表明,以血红素浓度为25μM建立铁超载模型,在干细胞的生长过程中加入载药角蛋白凝胶进行孵育,随着载药角蛋白凝胶浓度的升高,干细胞的存活率随之上升,当载药凝胶浓度达到400 mg/mL时,干细胞存活率增至80.65±2.36%(P<0.01)。在干细胞的诱导分化过程中,同样建立铁超载模型并利用载药角蛋白凝胶进行保护,免疫荧光染色结果显示载药角蛋白凝胶对其铁超载毒性具有较强的拮抗作用。(3)进一步在动物模型水平上评价角蛋白神经支架的初步生物学性能,通过向SD大鼠脑中注入氯化亚铁建立铁超载模型,同时给予双层角蛋白神经支架和单层角蛋白神支架进行移植治疗。普鲁氏铁染显示双层角蛋白神经支架可以有效的去除脑组织中的过载铁离子。脑水肿测定实验显示双层神经支架的植入可以减轻脑水肿。尼氏染色表明双层神经支架可以降低脑萎缩。神经功能评分实验表明双层神经支架移植组,对其神经功能的恢复具有良好的效果。Brdu&NeuN免疫荧光显示,双层神经支架下移植的干细胞,其生长分化状态优于单层神经支架,对其干细胞移植修复脑组织具有更好的效果。