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【背景】白血病是一类起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病,造血细胞的失控、恶性增殖为其疾病特点,同时伴随细胞分化障碍和凋亡抑制,最终导致正常造血细胞减少。成人中最为常见的白血病类型为急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML),追踪既往流行病学报告,AML的发病率与年龄密切相关,大于60岁的患者发病率显著上升,随着全球老龄化人口数量的不断加剧,AML的发病率也在逐年攀升,2013年欧洲AML的发病率已达到5/10万。据统计我国白血病的发病率在全球范围内处于中等水平,但结合我国庞大的人口基数水平,AML每年的发病人数也不容小觑。药物化疗和/或异基因移植是AML的主要治疗方法,尽管在过去的20年里,治疗方案的改进使得患者的预后得到了很大的改善,但超过2/3的患者最终面临复发和死亡。造血干细胞移植可以治愈AML,但早期确定适合移植的高危患者仍比较困难。目前大多数病人根据危险分层给予相应强度的化疗方案,但临床中许多疾病的复发会发生在最初具有良好预后特征的患者身上,由此说明还有很多未知的基因在患者疾病进展中发挥着重要作用,因此迫切需要找到更多新的预后生物标志物来完善成人AML的风险评估,了解它们在白血病中的作用以改善治疗方案的选择并使患者受益。精子相关抗原6(sperm associated antigen 6,SPAG6)是通过睾丸表达文库筛选出的一种新的人类精子抗原。SPAG6属于癌/睾丸抗原(cancer/testis antigen,CTA)的一种,是理想的肿瘤预后潜在标志物和治疗靶点。目前研究表明SPAG6在部分类别肿瘤中的表达发生异常,尤其是在血液系统肿瘤。SPAG6被证实参与调控部分实体肿瘤和血液肿瘤的发生和进展,其可能是诊断血液肿瘤的有效生物标志物,可作为肿瘤免疫治疗的候选基因。课题组前期研究结果提示SPAG6分子在骨髓增生异常综合征患者、骨髓增生异常综合征转白血病患者及相关细胞系中表达显著升高。但目前对SPAG6分子的相关研究尚不全面,对其在细胞中发挥的功能作用还未得到更深层次的了解,同时SPAG6在成人AML中的作用还未见报道。因此,深入探讨SPAG6可能的促进AML进展的作用和分子机制对于全面了解AML的疾病发展进程具有重要意义。【目的】1.明确SPAG6在成人AML患者中的表达情况,分析SPAG6的表达强度与成人AML患者预后之间的相关性。2.分析在不同的急性髓系白血病细胞株中SPAG6分子影响细胞相关生物学功能的作用。3.阐明SPAG6分子在急性髓系白血病中促进疾病进展的具体分子机制。【方法】1.选择收集本院初诊成人AML患者骨髓组织样本和不同AML公共数据库为研究对象,利用RT-q PCR和Western Blot检测SPAG6在AML患者及AML细胞系中的表达情况,同时利用数据库对AML患者进行预后分析。2.利用慢病毒转染在K562和HEL细胞中敲减SPAG6,在HL-60和THP-1细胞中过表达和敲减SPAG6,通过CCK-8、Ed U、甲基纤维素克隆形成、细胞周期、细胞迁移、细胞凋亡、细胞分化和Western Blot实验,探讨SPAG6分子对AML细胞生长产生的影响。3.构建NOD/SCID小鼠异种移植瘤模型,通过体内实验分析SPAG6对急性髓系白血病病程进展的影响。4.利用Co-IP及质谱检测探索与SPAG6相互作用的分子,利用Western Blot实验证实SPAG6影响AML细胞生长的内在分子机制。5.在稳转株K562-sh SPAG6和HEL-sh SPAG6中过表达MYO1D,稳转株HL-60-SPAG6和THP-1-SPAG6中干涉MYO1D表达,通过CCK-8、Ed U、迁移实验和构建NOD/SCID小鼠异种移植瘤模型,分析SPAG6与MYO1D如何相互作用来调控AML细胞生长。【结果】1.TCGA、GEO数据库和我们收集的AML临床骨髓标本均显示SPAG6在成人AML患者中的表达显著高于正常对照组(P<0.05),同时数据库分析提示SPAG6高表达的AML患者总生存期较SPAG6低表达的患者短(P<0.05)。TCGA数据库分析显示CALGB研究中AML患者合并的细胞遗传学异常高危特征与SPAG6的表达水平呈正相关(r=0.187,P<0.05)。2.在AML细胞系中敲减或过表达SPAG6,通过CCK-8、Ed U和甲基纤维素克隆形成实验证实SPAG6促进了细胞增殖,通过Transwell实验证实SPAG6促进了细胞的迁移,流式细胞仪检测和Western Blot实验证实SPAG6促进细胞周期G1至S期转换,最终效应是促进AML细胞存活,加速急性白血病的进程,但SPAG6对于细胞凋亡和分化未见明显作用。3.发现AML细胞中SPAG6与MYO1D相互结合并且定位于细胞质和细胞膜,SPAG6的变化并不影响细胞内MYO1D总量,SPAG6发挥类似“转运蛋白”的作用,促进了MYO1D从胞质向细胞膜的转位。4.SPAG6通过MYO1D介导的EGFR(除ERBB3外)家族的上调激活PI3K/AKT和ERK信号通路,促进了AML细胞的增殖和迁移,在AML疾病的进展中发挥着重要作用。【结论】我们通过分析不同数据集的生物信息学的内容,收集并完善临床骨髓组织样本的检测,同时进行体外细胞功能实验和体内动物模型实验的验证,发现SPAG6的表达在成人AML患者中显著升高,并且高表达SPAG6的患者较低表达SPAG6患者的预后差。SPAG6协同MYO1D通过EGFR家族介导促进AML细胞增殖和迁移,最终加速AML细胞的生长,促进AML疾病的进展。因此,SPAG6未来有可能成为判断AML预后的新的分子生物学标记物及AML靶向治疗的新靶点。