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肝脏是机体的重要代谢器官,具有着至关重要的复杂生理功能。由各种有害因素引发的肝损伤在临床极其常见,这可引起包括病毒性肝炎、药物性肝损伤、酒精性肝病、肝纤维化、肝硬化等在内的一系列急慢性肝病,发病率和死亡率均较高,是我国乃至世界范围内的重大健康问题。肝损伤的发病机制极为复杂,失控性炎症反应、过度的氧化应激、失调的损伤修复等被认为是肝损伤发生发展的关键环节。代谢反应是生命活动的基础,除可为细胞内的复杂分子反应提供能量和化学物质外,还会产生一系列具有生物活性的代谢产物,参与调控细胞信号转导,在生理功能的维持及病理损伤的发生发展中发挥重要作用。衣康酸是三羧酸循环中的副产物,由顺乌头酸经乌头酸脱羧酶催化产生,也被称为免疫应答基因1（immune responsive gene 1,IRG1）。衣康酸具有抗菌、抗炎、抗氧化等生物学特性。目前认为,衣康酸中亲电子的α,β-不饱和羧酸基团可直接修饰蛋白质上的半胱氨酸残基,参与调节信号转导和代谢反应。近期研究发现,IRG1/衣康酸可在过敏性哮喘、急性肺损伤、缺血再灌注损伤等多种疾病动物模型中发挥有效保护作用。因而,在某些病理条件下,IRG1/衣康酸可作为一种保护性代谢途径参与调控疾病发生发展,IRG1/衣康酸可望成为相关疾病药物干预的新靶点。那么,在急慢性肝损伤发生发展过程中,IRG1的表达及衣康酸的生成发生了怎样的变化?IRG1及其代谢生成的内源性衣康酸在急慢性肝损伤发生发展过程中发挥了怎样的作用?可穿透细胞膜的衣康酸衍生物在肝损伤中是否具有药理学价值?为解决这些问题,本研究在脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）/D-半乳糖胺（D-galactosamine,D-Gal）诱导的急性肝损伤和四氯化碳（carbon tetrachloride,CCl4）诱导的慢性肝纤维化两种动物模型中开展了相关研究,探讨了IRG1/衣康酸代谢途径在肝损伤中的病理意义及其药理价值。第一部分IRG1/衣康酸通过激活Nrf2及抑制AMPK-JNK减轻急性肝损伤研究背景与目的失控的肝细胞凋亡是各种肝脏疾病发生发展过程中的关键病理事件,受到一系列促凋亡和抗凋亡信号通路的严格调控。越来越多的证据表明,代谢反应与细胞凋亡等细胞生物学事件密切关联,代谢反应成为肝脏疾病发病机制及药物干预研究的新热点。衣康酸是三羧酸循环的副产物,由IRG1催化顺乌头酸产生。最近的研究表明,衣康酸在某些病理情况可发挥保护性作用,被认为是重要的内源性代谢检查点（checkpoint）。本研究探讨了IRG1/衣康酸在LPS/D-Gal诱导的肝细胞凋亡中的调控作用、相关机制及其药理意义。方法在本研究中,通过腹腔注射LPS（10μg/kg）和D-Gal（700mg/kg）在C57小鼠中诱导急性肝损伤。为了测定肝组织中的IRG1水平与衣康酸含量,在LPS/D-Gal暴露后0 h、2 h、4 h、6 h处死小鼠、采集肝脏样本,采用q PCR和Western Blot检测IRG1的表达水平,液相色谱质谱/质谱联用（Liquid Chromotography with Mass Spectrometry/Mass Spectrometry,LC-MS/MS）检测衣康酸含量。为探讨IRG1的病理生理意义,本研究将基因敲除杂合子小鼠互交获得IRG1敲除纯合子小鼠,提取鼠尾DNA鉴定小鼠的基因型,比色法检测IRG1敲除小鼠血清丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase,ALT）和天门冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase,AST）水平,肝组织石蜡包埋、切片、苏木精-伊红染色（Hematoxylin-eosin staining,HE）染色观察肝组织结构。为了研究IRG1在LPS/D-Gal诱导的急性肝损伤中的潜在作用,将野生型小鼠和IRG1敲除小鼠暴露于LPS/D-Gal以诱导急性肝损伤,6h后采集血清及肝组织,比色法检测血清中ALT和AST水平、肝组织内caspase-3、8、9的活性,Western Blot检测肝组织中切割型caspase-3、核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2）、血红素加氧酶-1（heme oxygenase 1,HO-1）、醌氧化还原酶1（NAD（P）H quinone oxyreductase1,NQO1）蛋白水平,Td T介导的d UTP缺口末端标记法（Td T-mediated d UTP Nick-End Labeling,TUNEL）检测凋亡阳性细胞数目,HE染色观察肝组织结构异常,比色法检测脂质氧化损伤标志物硫代巴比妥酸活性物质（thiobarbituric acid reactive substance,TBARS）含量及氧化型谷胱甘肽（oxidativeglutathione,GSSG）/还原型谷胱甘肽（glutathione,GSH）比值,酶联免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）测定血清DNA/RNA氧化损伤标志物8-羟基-2-脱氧鸟苷（8-hydroxy-2-deoxy Guanosine,8-OH-d G）水平。为了研究衣康酸在LPS/D-Gal诱导的急性肝损伤中的潜在意义,在LPS/D-Gal暴露的IRG1敲除小鼠中腹腔注射溶剂或4-辛基衣康酸（4-octyl itaconate,4-OI,200 mg/kg,溶解于DMSO）,6 h后处死小鼠收集血清及肝组织样本,比色法检测血清肝转氨酶ALT和AST水平、肝组织caspase-3、8、9的活性,Western Blot检测肝组织切割型caspase-3、Nrf2、HO-1、NQO1蛋白水平,TUNEL检测凋亡阳性细胞数目,HE染色观察肝组织结构病变,比色法检测肝组织内TBARS含量、GSSG/GSH比值,ELISA测定血清8-OH-d G水平。采用信号通路抗体芯片（CSP100 plus）来筛选潜在的信号通路,并用Western Blot验证相关通路的激活情况。根据抗体芯片的筛选结果,本研究随后探讨了AMPK与IRG1敲除小鼠肝损伤加重的关联,在LPS/D-Gal暴露的IRG1敲除小鼠中腹腔注射溶剂或AMPK抑制剂化合物C（compound C,15 mg/kg,溶解于DMSO）,6 h后处死小鼠收集血清及肝组织样本,比色法检测血清ALT和AST水平、肝组织内caspase-3、8、9的活性,Western Blot检测肝组织中切割型caspase-3、AMPK、p-AMPK、JNK、p-JNK蛋白水平,TUNEL检测凋亡阳性细胞数目,HE染色观察肝组织结构病变。我们前期研究发现c-Jun N末端激酶（c-Jun-N-terminal kinase,JNK）是AMPK下游的关键促凋亡靶点,为了研究JNK与IRG1敲除小鼠肝损伤加重的关联,在LPS/D-Gal暴露的IRG1敲除小鼠中腹腔注射溶剂或JNK抑制剂SP600125（50 mg/kg,溶解于DMSO）,6 h后处死小鼠收集血清及肝组织样本,比色法检测血清ALT和AST水平、肝组织内caspase-3、8、9的活性,Western Blot检测肝组织中切割型caspase-3、JNK、p-JNK蛋白水平,TUNEL检测凋亡阳性细胞数目,HE染色观察肝组织结构病变。采用Alb-Cre工具鼠与Nrf2-lox P小鼠杂交,获得肝细胞特异性Nrf2敲除的小鼠(Nrf2LKO),提取鼠尾DNA鉴定小鼠的基因型,采用Western Blot验证Nrf2蛋白水平,比色法检测小鼠血清转氨酶ALT和AST水平,HE染色观察肝组织结构。为了研究Nrf2介导的衣康酸保护作用中的潜在作用,在LPS/D-Gal暴露的Nrf2fl/fl对照小鼠或肝细胞特异性Nrf2敲除的小鼠(Nrf2LKO)中腹腔注射溶剂或4-OI,6 h后处死小鼠收集血清及肝组织样本。比色法检测血清ALT和AST水平、肝组织中caspase-3活性、肝组织内TBARS含量,Western Blot检测肝组织AMPK、p-AMPK、JNK、p-JNK蛋白水平,TUNEL检测凋亡阳性细胞数目,HE染色观察肝组织结构病变。为了研究氧化应激与IRG1敲除小鼠肝损伤加重的关联,在LPS/D-Gal暴露的IRG1敲除小鼠中腹腔注射溶剂或N-乙酰半胱氨酸（NAC,120 mg/kg,溶解于生理盐水中）。6 h后处死小鼠收集血清及肝组织样本,比色法检测血清ALT和AST水平、肝组织内caspase-3、8、9的活性,Western Blot检测肝组织中切割型caspase-3、AMPK、p-AMPK、JNK、p-JNK蛋白水平,TUNEL检测凋亡阳性细胞数目,HE染色观察肝组织结构病变,比色法检测肝组织内TBARS含量、GSSG/GSH比值,ELISA测定血清8-OH-d G水平。为了研究4-OI在LPS/D-Gal诱导的急性肝损伤中的药理价值,在LPS/D-Gal暴露前0.5 h或暴露后1.5 h给予腹腔注射溶剂或4-OI,6 h后处死小鼠收集血清及肝组织样本,比色法检测ALT和AST水平、肝组织内caspase-3、8、9的活性,Western Blot检测肝组织中切割型caspase-3、AMPK、p-AMPK、JNK、p-JNK、Nrf2、HO-1、NQO1蛋白水平,TUNEL检测凋亡阳性细胞数目,HE染色观察肝组织结构病变,比色法检测肝组织内TBARS含量、GSSG/GSH比值,ELISA测定血清8-OH-d G水平。另外一组动物进行生存率分析,每6 h记录一次实验动物的存活率,持续7天,并通过Kaplan-Meier曲线分析小鼠的存活率。结果1.在本研究中,LPS/D-Gal暴露小鼠肝脏组织中IRG1的m RNA和蛋白质水平随着时间点不同均显著上调。2.敲除IRG1不引起小鼠血清转氨酶的升高和肝脏组织学明显异常。在LPS/D-Gal暴露的IRG1敲除小鼠中,IRG1蛋白表达缺失,血清转氨酶升高程度超过野生型小鼠,IRG1敲除肝组织病理损伤较野生型小鼠更严重。与此一致,IRG1敲除小鼠肝内caspase级联激活、切割型caspase-3蛋白水平、TUNEL阳性细胞计数均高于野生型小鼠,这些结果表明,IRG1的上调可能是LPS/D-Gal诱导的急性肝损伤中的一种保护反应。3.在LPS/D-Gal诱导的急性肝损伤中,野生型小鼠肝组织中衣康酸含量增加与IRG1表达上调相一致,而IRG1敲除小鼠中难以检测到衣康酸。补充可穿透细胞膜的衣康酸衍生物4-OI可抑制ALT、AST的升高,减轻肝组织病理学异常,抑制切割型caspase-3蛋白水平的增高和caspase的级联激活,减少TUNEL阳性细胞数量。这些结果表明,衣康酸含量的减少可能与IRG1敲除小鼠肝脏损伤加重有关。4.抗体芯片分析发现,与野生型小鼠相比,IRG1敲除小鼠中19种磷酸化蛋白质的水平上调,14种磷酸化蛋白质的水平下调。京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopaedia of Genes and Genomes,KEGG）分析发现这些发生变化的信号蛋白主要富集于AMPK信号通路。Western Blot结果显示,在IRG1敲除小鼠中,LPS/D-Gal诱导的AMPK磷酸化显著增强,而在敲除小鼠中补充4-OI可逆转增强的AMPK磷酸化修饰。这些结果表明AMPK的磷酸化水平增强可能与IRG1敲除小鼠中加重的肝细胞凋亡和肝组织损伤相关。5.为了研究IRG1敲除是否通过增强AMPK磷酸化来加重脏损伤,AMPK抑制剂化合物C经腹腔注入LPS/D-Gal暴露的IRG1敲除小鼠中。结果显示,AMPK抑制剂干预可抑制IRG1敲除小鼠中增强的AMPK磷酸化修饰。IRG1敲除小鼠中加重的血清ALT和AST升高、上调的切割型caspase-3蛋白水平、增强的caspase级联激活、升高的TUNEL阳性细胞数目及加重的肝组织学异常均可被AMPK抑制剂逆转。因此,AMPK激活增强可能是IRG1敲除小鼠肝损伤加重的关键机制。6.在IRG1敲除小鼠中,LPS/D-Gal诱导的JNK磷酸化也显著增强,在敲除小鼠中补充4-OI或AMPK抑制剂可逆转增强的JNK磷酸化修饰,这表明,JNK的磷酸化受到衣康酸和AMPK的调节。为探讨IRG1敲除是否通过增强JNK磷酸化来加重脏损伤,JNK抑制剂SP600125经腹腔注入LPS/D-Gal暴露的IRG1敲除小鼠中。结果显示,SP600125可抑制IRG1敲除小鼠中增强的JNK磷酸化修饰。IRG1敲除小鼠中加重的血清ALT和AST升高、上调的切割型caspase-3蛋白水平、增强的caspase级联激活、升高的TUNEL阳性细胞数目及加重的肝组织学异常均可被JNK抑制剂逆转。因此,AMPK/JNK通路激活增强可能是导致IRG1敲除小鼠肝损伤加重的关键途径。7.与野生型小鼠相比,IRG1敲除小鼠的肝组织中,Nrf2水平及其下游靶蛋白HO-1和NQO1水平明显降低,这伴随有TBARS水平、GSSG/GSH比值和8-OH-d G水平升高。而在IRG1敲除小鼠中补充4-OI可显著提升Nrf2、HO-1和NQO1的水平,抑制TBARS、GSSG/GSH和8-OH-d G的升高,表明受抑的Nrf2信号传导和增强的氧化应激可能与IRG1敲除小鼠中的衣康酸缺乏有关。8.为了研究衣康酸是否通过Nrf2减轻肝细胞损伤,我们繁育了肝细胞特异性Nrf2敲除(Nrf2LKO)小鼠。结果显示Nrf2LKO小鼠血清ALT和AST水平、肝组织学结构与对照(Nrf2fl/fl)小鼠无明显差异。在LPS/D-Gal诱导的急性肝损伤中,4-OI干预可抑制Nrf2fl/fl小鼠中TBARS、ALT水平升高,但4-OI不能抑制Nrf2LKO小鼠中TBARS、ALT水平升高和组织学异常。此外,在Nrf2LKO小鼠中,4-OI对LPS/D-Gal诱导的AMPK/JNK磷酸化和caspase-3激活也无抑制作用。因此,4-OI对肝细胞的保护作用依赖于Nrf2。9.在LPS/D-Gal暴露的IRG1敲除小鼠中,抗氧化剂NAC干预可显著降低TBARS、GSSG/GSH和8-OH-d G水平,NAC干预也可逆转IRG1敲除小鼠中增强的AMPK/JNK磷酸化。此外,IRG1敲除小鼠中加重的血清ALT和AST升高、上调的切割型caspase-3蛋白水平、增强的caspase级联激活、升高的TUNEL阳性细胞数目及加重的肝组织学异常均可被NAC逆转。因此,增强的氧化应激可能是IRG1敲除小鼠中AMPK/JNK激活增强和肝细胞损伤加重的关键原因。10.4-OI预处理可减轻LPS/D-Gal诱导的急性肝损伤,表现为切割型caspase-3蛋白水平下调、caspase级联激活受抑、TUNEL阳性细胞数目减少、血清ALT和AST水平降低、肝组织学病变减轻。更有意义的是,4-OI后处理仍可上调Nrf2、HO-1和NQO1含量,降低TBARS、GSSG/GSH和8-OH-d G的水平,抑制AMPK和JNK的磷酸化,抑制caspase-3的切割及caspase级联激活,减少TUNEL阳性细胞数目,下调ALT和AST的水平,减轻组织学病变程度,并提高实验小鼠的存活率。结论在LPS/D-Gal诱导的急性肝损伤中,IRG1/衣康酸的上调可能是一种内源性保护反应,IRG1/衣康酸可能通过增强Nrf2抗氧化通路、抑制氧化-还原敏感（redox-sensitive）的AMPK/JNK促凋亡通路的激活来减轻肝细胞损伤。IRG1/衣康酸可能是急性肝损伤中的重要代谢检查点,衣康酸衍生物可能在急性肝损伤的干预中具有潜在应用价值。第二部分IRG1/衣康酸抑制TGF-β1/Smad3通路并减轻肝纤维化研究背景与目的慢性肝病通常伴随着受损肝脏修复失调和纤维生成增强,最终导致肝纤维化,甚至发展成肝硬化。尽管肝纤维化发生的分子机制和抗纤维化的药物已有广泛研究,肝纤维化仍然是全球范围内的重大健康问题。越来越多的资料表明,代谢反应在肝纤维化的发生发展中发挥着重要的调控作用。我们前面发现IRG1/衣康酸上调是急性肝损伤中的重要代谢保护机制,本研究继续探讨了IRG1/衣康酸在肝纤维化中的病理意义和药理价值。方法检索NCBI GEO数据库,对数据库中包含健康对照肝组织和纤维化肝组织样本的2条数据集中的差异表达基因进行分析,重点关注IRG1的表达情况。随后通过腹腔注射CCl4（1 ml/kg,溶于橄榄油,每周2次,持续4周）诱导小鼠肝纤维化,采用q PCR和Western Blot检测模型小鼠肝组织中IRG1的表达水平。为了研究IRG1在小鼠肝纤维化中的病理意义,在野生型WT和IRG1敲除小鼠中诱导肝纤维化,比较肝脏大体形态学异常变化和肝脏指数,采用HE染色、Masson染色、天狼星染色观察肝组织病理学变化,比色法检测肝组织羟脯氨酸含量、GSSG/GSH比值,q PCR法检测肝组织TGF-β1 m RNA水平,ELISA法检测肝组织TGF-β1含量,Western Blot法检测肝组织胶原蛋白Ⅰ（collagen type I,collagen-I）、α-平滑肌肌动蛋白（alpha smooth muscle actin,α-SMA）、Smads家族蛋白3（SMAD family member 3,Smad3）、p-Smad3、Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白水平。为了研究4-OI在小鼠肝纤维化中的药理价值,在CCl4诱导的肝纤维化小鼠中,每天腹腔注射溶剂或4-OI（100 mg/kg,溶解于DMSO）,观测4-OI对肝内Nrf2通路激活情况、氧化应激水平、TGF-β1/Smad3活化水平、胶原含量及肝组织学病变程度的调节效应,实验方法同上。结果1.在NCBI GEO数据库中,检索到2条符合要求的数据集:GSE110096和GSE157814,差异表达基因分析发现,在GSE110096和GSE157814中,分别有3049个上调基因和3338个上调基因,均包含IRG1。在CCl4诱导的肝纤维化小鼠,肝组织中IRG1的m RNA和蛋白水平均显著增加。这些结果表明,在CCl4诱导的小鼠肝纤维化模型中,肝组织中IRG1蛋白水平上调。2.与野生型小鼠比较,IRG1敲除小鼠肝脏肿胀及肝表面斑块等异常表现明显加重,肝脏指数升高,HE染色发现肝组织内结缔组织积聚和纤维化隔膜形成明显增强,Masson染色及天狼星红染色均显示IRG1敲除小鼠肝组织中胶原沉积增强,Western Blot结果表明,IRG1敲除小鼠肝组织中I型胶原蛋白水平高于野生型小鼠。此外,与野生型小鼠相比,IRG1敲除小鼠肝组织中羟脯氨酸含量增加。可见,IRG1敲除小鼠的肝纤维化加重,这表明IRG1的上调可能也是肝纤维化发展中的一种保护性代谢反应。3.与野生型小鼠相比,IRG1敲除小鼠肝脏中CCl4诱导的TGF-β1m RNA水平和蛋白质水平上调显著增强,这伴随有Smad3磷酸化水平进一步升高,α-SMA表达水平进一步增加。这些结果表明IRG1敲除增强了纤维化肝脏中TGF-β1/Smad3通路。4.在发生纤维化的肝组织内,IRG1敲除小鼠Nrf2、NQO1和HO-1水平低于野生型小鼠,而反映氧化应激水平的GSSG/GSH比值升高。这些结果表明IRG1敲除导致肝组织内Nrf2信号受抑。5.在CCl4诱导的肝纤维化小鼠,补充4-OI可提升肝组织中Nrf2、HO-1、NQO1蛋白水平,降低GSSG/GSH比值,下调TGF-β1含量、降低Smad3磷酸化水平和α-SMA水平。补充4-OI可减轻模型小鼠肝脏大体异常,降低肝脏指数,减轻HE染色、Masson染色和天狼星红染色中的肝组织学异常,减少肝组织中I型胶原蛋白水平和羟脯氨酸含量。这表明,补充4-OI可增强Nrf2介导的抗氧化防御反应、抑制促纤维化的TGF-β1/Smad3通路、减轻肝纤维化。结论本研究实验数据表明IRG1的上调可能在肝纤维化的发生发展中发挥保护作用,IRG1可通过增强Nrf2、抑制TGF-β1/Smad3通路发挥抗纤维化效应,衣康酸衍生物在肝纤维化的药物干预中具有潜在应用价值。