副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，Vp）为一种嗜盐性弧菌，能导致人类食物中毒和旅游者腹泻，还能导致反应性关节炎、心脏疾病等。目前研究认为副溶血弧菌的主要致病因子是其产生的多种溶血毒素，而临床上检测到的致病菌大多具有溶血现象（亦称神奈川现象），基因水平研究发现该类病原体都携带tdh基因，编码TDH（thermostable direct hemolysin，TDH）。不耐热溶血毒素（thermolabile hemolysin，TLH）也是其产生的毒素之一，研究表明副溶血弧菌无论是临床分离株，还是环境分离株都含有tlh基因，且具有种属特异性。 本研究应用基因工程技术克隆了tdhA、tdhS和tlh基因，并实现在原核融合表达载体pGEX-4T-1上经IPTG诱导得到高效表达，并获得纯化蛋白。同时制备了抗TDH兔血清，期望为下一步研究奠定基础。 根据GenBank上已有的副溶血性弧菌耐热直接溶血毒素的基因序列，设计并人工合成引物，并在5’端与3’端分别增加BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点，应用PCR技术从致病性副溶血弧VP ATCC33846，VP ATCC33847株扩增了tdh基因，PCR产物经BamHⅠ，EcoRⅠ双酶切回收后定向插入pGEX-4T-1表达载体，测序分析结果表明tdh基因的开放阅读框（ORF）为570nt，编码由189个氨基酸组成、分子量为23kDa的耐热直接溶血素。 应用clustalW/Bioedit/Alignx Application等分子生物学软件分析，显示获得的VP ATCC33846、ATCC33847 tdhS基因测序结果与GenBank中的副溶血弧菌tdhS基因序列（gi_28899855：1450728-1451497）具有100％的同源性。获得的VPATCC33846 tdhA基因测序结果与GenBank中的副溶血弧菌tdhA基因序列（gi_28899855：1391810-1392679）具有98．95％的同源性。在第57位（A-G），第78、79、80位（GCT-TTA），第97、98位（CC-TA）有碱基差别，但它们所编码的蛋白质序列是相同的。获得的VP ATCC33847 tdhA基因测序结果与GenBank中的副溶血弧菌tdhA基因序列（gi_28899855：1391810-1392679）具有100％的同源性。 将PCR产物与pGEX-4T-1构建的重组质粒成功的转化了E．coli TG1与BL21（DE）工程菌株，SDS-PAGE分析表明经IPTG诱导后重组菌在迁移率为49kD位置上出现一条明显的蛋白带，而其载体自身带有26KDGST蛋白带消失，由此推断，49KD蛋白是由tdh基因编码的23kD蛋白与GST基因编码的26KD蛋白连接后形成的融合蛋白。通过Glutathione Sephrose4B亲和柱层析纯化TDH融合蛋白。 用同样的方法构建了tlh/pGEX-4T-1并经鉴定后转化、诱导表达。获得的VP ATCC33846、ATCC33847 tlh基因测序结果与GenBank中的副溶血弧菌WP1标准株tlh基因序列具有100％的同源性。他们所编码的蛋白质序列也是相同的。 以纯化的TDH为抗原，背部皮下注射免疫大白兔，制备抗TDH多抗。免疫学分析证实纯化的表达产物能被TDH特异性抗血清所识别，当包被的TDH为1ug/mL时，抗血清的ELISA效价达到4．0×105，获得效价较高的抗体。DNA序列分析和免疫学分析证明所克隆的基因是副溶血弧菌的tdh基因，且重组菌表达的TDH与原始菌株产生的TDH抗原性一致。副溶血弧菌tdh基因克隆与表达，为在单因子水平上研究副溶血弧菌TDH的毒力、致病机理以及诱导宿主免疫应答方面的作用打下了基础。同时为建立基于溶血毒素检测副溶血弧菌的方法奠定了基础。