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1研究目的和意义:结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是最常见的消化系统恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率在所有恶性肿瘤中分别排第3位和第2位,且在我国呈逐年上升趋势。林奇综合征是最常见的遗传性结直肠癌综合征,由错配修复基因种系突变引起,常表现为高度微卫星不稳定（Microsatellite Instability-High,MSI-H）和错配修复功能缺失（MMR deficiency,dMMR）。大量研究已证实MSI-H/dMMR状态的实体瘤患者可从PD-1/PD-L1抑制剂为代表的免疫治疗中显著获益,但也同步面临药物耐药的挑战。RAS基因突变已被证实可上调肿瘤细胞PD-L1的表达并作用于PD-1,增强mRNA的稳定性,使得癌细胞具备更强的免疫抑制的能力。那么在兼具dMMR和RAS突变特征的林奇综合征RAS突变亚型与PD-1治疗之间,不同类别的非编码RNA在其相关耐药机制中是否可起到应对PD-1耐药的作用将是本研究的重点。我们将以分析林奇综合征患者转录组特征和临床病理及预后情况作为基础,以RAS突变与PD-1耐药相关的通路和靶基因作为切入点,分析和挖掘林奇综合征RAS突变亚型与PD-1之间关联的信号通路和靶基因,进一步阐明林奇综合征RAS突变亚型与PD-1耐药之间可能的潜在分子机制,以期发现可用于改善林奇综合征免疫治疗耐药的分子,这将有助于推广到MSI-H/dMMR实体瘤个体化免疫治疗手段的拟定,为免疫治疗耐药的应对策略提供理论基础。2研究方法:2.1林奇综合征lncRNA转录组特征分析通过对临床基线资料匹配后,选取3例遗传性结直肠癌（林奇综合征）癌组织作为实验组,6例非遗传性结直肠癌（散发性结直肠癌）癌组织作为阳性对照组和其癌旁远端正常肠粘膜组织作为阴性对照组。通过高通量测序检测组织中lncRNA的表达情况,筛选差异表达lncRNA并对其靶基因进行功能注释和富集分析,全面系统分析林奇综合征lncRNA的转录组特征。结合转录特征挖掘RAS基因突变与PD-1耐药相关的lncRNA靶基因和相关通路。2.2林奇综合征circRNA转录组特征分析方法同前全面系统分析林奇综合征circRNA的转录组特征,并挖掘RAS基因突变与PD-1耐药相关的circRNA靶基因和相关通路。2.3林奇综合征miRNA转录组特征分析方法同前全面系统分析林奇综合征miRNA的转录组特征,并挖掘RAS基因突变与PD-1耐药相关的miRNA靶基因和相关通路。2.4林奇综合征mRNA转录组特征分析方法同前全面系统分析林奇综合征mRNA的转录组特征,并挖掘RAS基因突变与PD-1耐药相关的mRNA靶基因和相关通路。2.5林奇综合征RAS突变亚型的临床病理分析回顾性分析林奇综合征RAS突变亚型患者的临床病理因素和预后情况。利用生物信息学分析挖掘链接PD-1和RAS信号通路的靶基因,结合前期对林奇综合征患者的转录组特征分析结果,寻找与林奇综合征RAS突变亚型PD-1耐药机制相关通路及靶基因。3研究结果:3.1林奇综合征lncRNA转录组特征分析lncRNA占总RNA表达量的41%,在林奇综合征中主要集中在14号染色体上表达。相比于正常肠粘膜组织,筛选出林奇综合征1178个上调和2242个下调的lncRNA,两组散发性结直肠癌分别各1749和1961个上调lncRNA与各1734个和1901个下调的lncRNA。通过趋势分析,发现24条信号通路仅受林奇综合征特异差异表达的lncRNA调控,11条信号通路受林奇综合征和散发性结直肠癌共有的差异表达的lncRNA的调控,其中细胞凋亡通路和HTLV-1感染通路在分别位列显著性前十位。在对RAS基因突变与PD-1耐药相关的lncRNA分析发现,差异表达的lncRNA所富集的MAPK信号通路和癌症中蛋白聚糖通路与PD-1和RAS信号通路的1个靶基因相关。3.2林奇综合征circRNA转录组特征分析circRNA占总RNA表达量的4%,在林奇综合征中主要集中在6号染色体上表达。相对于正常肠粘膜组织,筛选出林奇综合征112个上调和324个下调的circRNA,两组散发性结直肠癌均149个上调circRNA和各273个和261个下调的circRNA。通过趋势分析,发现2条信号通路受林奇综合征特有差异表达的circRNA调控,即Rap1信号通路和Fanconi贫血;有4条信号通路受林奇综合征和散发性结直肠癌共有差异表达的circRNA调控。分析RAS基因突变与PD-1耐药相关的circRNA发现,PI3K-Akt和VEGF信号通路有统计学差异,其中PI3K-Akt信号通路的靶基因为ITGA7和PTK2,而VEGF信号通路的靶基因为PTK2。3.3林奇综合征miRNA转录组特征分析miRNA占总RNA表达量的4%,在林奇综合征中主要集中在7号染色体上表达。相对于正常肠粘膜组织,筛选出林奇综合征143个上调和147个下调的miRNA,两组散发性结直肠癌各90个和100个上调miRNA和各95个和90个下调的miRNA。通过趋势分析,有4条信号通路受林奇综合征特有差异表达的miRNA调控。有46条信号通路受林奇综合征和散发性结直肠癌共有的差异表达的miRNA调控,其中MAPK信号通路和粘着斑通路位列显著性前十位。在对RAS基因突变与PD-1耐药相关的miRNA分析发现,差异表达的所有miRNA所富集的RAS信号通路、PI3K-Akt信号通路和VEGF信号通路均有统计学意义。林奇综合征差异表达miRNA所富集的有统计学意义的通路中,Ras信号通路、PI3K-Akt信号通路、Rap1信号通路、癌症通路和癌症的中心碳代谢通路共5条通路的靶基因均包含链接RAS基因突变和PD-1耐药的基因,另外还有MAPK信号通路、肌动蛋白细胞骨架的调节、调节干细胞多能性的信号通路、前列腺癌共4条通路的靶基因包含了 FGFR1和FGFR2。抗EGFR酪氨酸激酶抑制剂、蛋白聚糖在癌症、Adherens结、黑素瘤、杀菌作用、急性髓系白血病共6条信号通路包含3个靶基因之一。3.4林奇综合征mRNA转录组特征分析mRNA总RNA表达量的51%,林奇综合征的mRNA主要集中在6号染色体上表达。与正常肠粘膜组织对比,筛选出林奇综合征1498个上调表达的mRNA和2594个下调表达的mRNA,两组散发性结直肠癌各1280个和1579个上调mRNA,各1758个和1951个下调的mRNA。林奇综合征组中的RAS信号通路或链接其与PD-1耐药靶基因的相关通路均无统计学意义。3.5林奇综合征RAS突变亚型的临床病理因素分析纳入28例林奇综合征的结直肠癌患者,其中RAS突变型和RAS野生型各9例和19例。临床病理分析发现,9例林奇综合征RAS突变亚型患者均为微卫星不稳定缺失型和BRAF基因野生型,其中2例患者存在PI3K基因突变。在错配修复功能缺失方面,林奇综合征RAS突变亚型患者中有4例存在MLH1和PMS2缺失,3例MLH6缺失和2例MLH2缺失。生存分析发现两组的OS和PFS无统计学差异,但非RAS基因突变亚型组中位生存时间和无瘤生存时间均优于RAS基因突变亚型组4研究结论:（1）lncRNA、circRNA、miRNA和mRNA在林奇综合征和散发性结直肠癌中均存在差异表达,且在林奇综合征患者中的差异更显著。（2）林奇综合征特异性表达的差异基因在不同类别的RNA层面与不同的通路改变有关:在lncRNA层面可能与细胞凋亡通路有关;在circRNA层面可能与Fanconi贫血和Rap1信号通路有关;在miRNA层面可能与逆反神经信号通路、脂肪酸代谢通路、鞘脂类代谢通路、内分泌和其他因素调节的钙重吸收通路有关。（3）对RAS基因突变和PD-1耐药的相关性研究发现,林奇综合征差异表达的RNA中与之关联度较大的是miRNA,关联度中等的是circRNA,关联度较小的是lncRNA,而mRNA未发现有关联。（4）林奇综合征RAS突变亚型的PD-1耐药的分子机制可能是,特定的circRNA或lncRNA可作为miRNA海绵体或蛋白结合体,在miRNA作用于mRNA调控PD-1免疫应答时,因mRNA受到RAS突变的影响而无有效的靶点和信号通路,从而使mRNA保持稳定并具有更强的免疫抑制的能力,从而导致PD-1耐药。（5）探寻作用于miRNA或circRNA等非编码RNA上相关分子和通路的治疗方式,有望找到应对林奇综合征免疫治疗耐药的有效途径,并进一步推广到MSI-H/dMMR实体瘤个体化免疫治疗策略的拟定。