新生隐球菌是一种有荚膜的酵母样真菌,最初可以定植到肺组织,之后逐渐感染全身多个脏器,但最常侵犯中枢神经系统,在免疫功能低下者,特别是艾滋病晚期患者中会引起较高致死率的隐球菌性脑膜炎。随着新的自身免疫和癌症免疫抑制方案的发展,新生隐球菌高危感染人群正在扩大^[1]。据报道,每年大约有100万人被确诊患有隐球菌病,65万人最终死亡,其中80%的案例发生在撒哈拉以南的非洲^[2],隐球菌病的症状隐匿且治疗复杂,大部分进展到隐球菌性脑膜炎阶段才会出现明显症状^[3],这就造成隐球菌病的难治性及高死亡率。然而,除2002年发布的伏立康唑外,将近17年没有治疗隐球菌病的新药问世^[4]。美国传染病学会在2010年的隐球菌病管控指南中强调,在没有理想的抗隐球菌药物的情况下,隐球菌感染人管控的重要原则仍然是诊断隐球菌病,调节宿主免疫力以及抗隐球菌毒性的治疗。由于当前治疗药物的两难选择（即药物功效与副作用）以及患者的高死亡率,迫切需要发现新的治疗靶点及开发新的抗真菌药物来诊断和治疗隐球菌病。因此,本研究着重探讨新生隐球菌感染中枢神经系统后的免疫调控与炎症应答,为隐球菌性脑膜炎的诊疗提供一定思路和方向。巨噬细胞是单核细胞分化的免疫吞噬细胞,几乎存在于所有组织中,通过识别、吞噬和破坏病原体,在新生隐球菌入侵机体期间参与第一道免疫防线。小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）内参与新生隐球菌免疫监视的巨噬细胞,在微生物入侵中枢神经系统时,小胶质细胞不仅可以显著改变其形态还可以迅速上调大量受体,分泌被认为有助于免疫防御或对大脑有潜在损害的物质,小胶质细胞免疫反应的效率决定了新生隐球菌感染的结果是在机体内处于潜伏状态还是播散状态。由于血脑屏障（BBB）的隔离作用,使得中枢神经系统与其他外周器官分离。小胶质细胞的活化增强了先天免疫反应以及对侵袭性细菌或真菌的吞噬能力,从而保护神经元细胞^[5,6]。探究小胶质细胞、先天免疫与新生隐球菌之间的关系,可以帮助我们对隐球菌性脑膜炎发病机制的认识。MicroRNA（miRNA）是一类长度约为20～24 nt非编码小RNA分子,miRNAs可以通过降解m RNA或阻止翻译导致基因表达缺失,从而在转录后水平在信号转导、细胞分化、免疫应答及细胞癌变等层面对靶基因进行调控。最近,miRNAs在真菌感染的免疫反应中的作用已被证实。miR-21、miR-146、miR-132、miR-155和let-7家族调节病菌感染后机体的炎症反应,miRNA对真菌暴露的反应与炎症和过敏反应相似^[7-12]。已经发现miR-4792在鼻咽癌,子宫平滑肌瘤,粘膜下纤维化期间和胶质母细胞瘤浸润的CD14⁺细胞中被下调,相反,miR-4792在神经胶质瘤微泡中被上调^[13-17]。在中枢神经系统中,EGFR在星形胶质细胞,神经元少突胶质细胞和小胶质细胞中表达^[18,19]。EGFR介导EGF诱导的小胶质细胞趋化和化学动力学迁移^[20],其主要信号传导途径包括Ras-Raf-丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号传导途径,抑制EGFR/MAPK信号传导可阻止小胶质细胞炎症反应^[21],MAPK信号通路的激活对于IL-1β,TNF-α和IL-6等炎性细胞因子的产生至关重要,并通过其对基因表达的影响来调节细胞的存活,分化和增殖^[22,23]。感染白念珠菌的口腔上皮细胞可激活三个MAPK亚家族并增强炎症介质的产生。申克孢子丝菌酵母感染树突状细胞后,可诱导JNK,ERK1/2和p38 MAPK的强烈活化,这与IL-6和TNF-α的分泌有关。最新的研究表明,miR-4792通过MAPK途径参与RTHF对A549细胞的凋亡诱导,并决定其潜在的凋亡机制^[24]。我们在之前的研究中发现用新生隐球菌感染THP-1细胞后,miR-4792表达明显上调^[7],此外,通过前期miRanda、Targetscan等网站预测,我们发现miR-4792保守结合位点的潜在靶基因EGFR,而EGFR基因及MAPK信号通路均参与细胞炎症及凋亡反应。本研究以miR-4792在新生隐球菌感染小胶质细胞炎性反应过程中的分子机制及信号通路为研究内容,探讨miR-4792靶向相关基因在新生隐球菌致病的作用机制。我们观察新生隐球菌（WM148）感染小鼠BV2细胞后miR-4792、EGFR及炎症因子的表达变化;应用双荧光素酶实验验证miR-4792与EGFR的结合位点;观察EGFR抑制剂AG1478干预WM148感染的小胶质细胞后靶基因EGFR、MAPK信号通路及炎症因子的变化;观察miR-4792mimics干预WM148感染的小胶质细胞后靶基因EGFR、MAPK信号通路及炎症因子的变化;观察隐球菌性脑膜炎患者有效治疗前后miR-4792及EGFR的表达变化。分析miR-4792靶向EGFR/MAPK在新生隐球菌感染小胶质细胞炎性反应中的作用及可能的机制,从而为进一步探究隐球菌性脑膜炎致病机制提供理论基础和实验数据依据。一、新生隐球菌感染BV2细胞后miR-4792、EGFR的表达变化更换细胞液,调整好BV2细胞（小鼠小胶质细胞系）的生长状态,用灭活的新生隐球菌按照数量5:1加入5瓶细胞培养瓶中,分别在干预0h、3h、6h、9h、12h后收取细胞,存放于-80℃冰箱中。用Trizol法提取细胞RNA,用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-q PCR）测定miR-4792和EGFR的表达倍数变化。我们研究发现在感染新生隐球菌后,BV2细胞中miR-4792表达降低,其中在6h达到最低值,EGFR表达量增高,在3h、6h、9h、12h有统计学差异,前期实验发现TNF-α和IL-6的表达量随时间明显增加,IL-1β无明显规律。二、双荧光素酶报告系统及免疫印迹实验验证miR-4792和EGFR的靶向关系根据miRanda、Targetscan网站预测结果,miR-4792与EGFR有结合位点,为了进一步验证该靶向关系,我们进行了双荧光素酶报告实验:将实验分为6组,分别是海肾荧光素酶（p RL）质粒+mimics NC、p RL质粒+miR-4792、p RL质粒+EGFR 3’UTR+mimics NC、p RL质粒+EGFR 3’UTR+miR-4792、p RL质粒+EGFR 3’UTR-mut+mimics NC、p RL质粒+EGFR 3’UTR-mut+miR-4792。将细胞根据分组放入24-well培养板中培养,后转染质粒共孵育24h,后在荧光显微镜观察明确目的荧光标记基因表达良好的情况下,使用“Dual-Luciferase?Reporter Assay System（E1910,promega）”试剂盒处理细胞、检测荧光素酶的表达水平。我们研究发现实验组较对照组荧光值降低了31%,表明miR-4792可靶向降解EGFR m RNA 3’UTR,而将EGFR 3’UTR突变后,其活性较野生型增加了28%,表明该突变位点对于miR-4792的结合很重要,可能是其相互作用的位点。此外我们将新生隐球菌感染BV2细胞6小时后,用miR-4792 mimics共孵育24小时,提取蛋白,后采用免疫印迹方法对目的蛋白进行显色。结果提示加入miR-4792mimics后p-EGFR的表达量显著下降,进一步验证miR-4792可以靶向EGFR,对其进行负向调控。三、验证EGFR抑制剂（AG1478）对EGFR、BV2细胞活化及miR-4792的调控作用更换细胞液,调整好BV2细胞的生长状态,用灭活的新生隐球菌按照数量5:1加入细胞培养瓶中。将实验分为3组,分别是0h对照组、6h感染组、6h感染+EGFR抑制剂（AG1478）组。我们研究发现WM148感染6小时后,免疫印迹分析显示小胶质细胞激活标记物CD11b明显升高,p-EGFR表达量也显著升高;而在加入EGFR抑制剂（AG1478）共孵育24小时后,免疫印迹分析提示CD11b及p-EGFR表达量明显下降;RT-q PCR提示6h感染+EGFR抑制剂（AG1478）组相比6h感染组而言,EGFR的表达量显著下降,而miR-4792的表达量显著升高,进一步明确miR-4792与EGFR的靶向关系。四、EGFR抑制剂（AG1478）对MAPK通路及相关炎症因子的表达的调控作用更换细胞液,调整好BV2细胞的生长状态,用灭活的新生隐球菌按照数量5:1加入细胞培养瓶中。将实验分为2组,分别是6h感染组、6h感染+EGFR抑制剂（AG1478）组。提取细胞蛋白及上清液,进行免疫印迹分析及炎症因子悬液微珠芯片结果分析。我们研究发现6h感染+EGFR抑制剂（AG1478）组相比6h感染组而言,p-ERK、p-P38表达明显下降,差异有统计学意义,p-JNK表达下降,差异无统计学意义;TNF-α、IL-1β表达显著下降,其他炎症因子IL-1α,IL-12,Eotaxin,GM-CSF,MCP-1/CCL2表达下降。这说明AG1478可以抑制MAPK通路及相关炎症因子的表达。五、miR-4792 mimics对MAPK通路及相关炎症因子的表达的调控作用更换细胞液,调整好BV2细胞的生长状态,用灭活的新生隐球菌按照数量5:1加入细胞培养瓶中。将实验分为2组,分别是6h感染组、6h感染+miR-4792 mimics组。提取细胞蛋白及上清液,进行免疫印迹分析、RT-q PCR及炎症因子悬液微珠芯片结果分析。我们研究发现加入miR-4792 mimics共孵育24h后与仅用WM148感染6h组相比,免疫印迹分析显示小胶质细胞激活标记物CD11b降低;p-ERK、p-P38表达明显下降,差异有统计学意义,p-JNK表达下降,差异无统计学意义;TNF-α、IL-1β表达显著下降,其他炎症因子IL-1α,IL-12,Eotaxin,GM-CSF,MCP-1/CCL2表达下降。这表明miR-4792 mimics可以抑制MAPK通路及相关炎症因子的表达。此外,RT-q PCR结果提示miR-4792 mimics可以明显提高miR-4792的表达量,miR-4792 inhibitor可以明显降低miR-4792的表达量;然而miR-4792 mimics虽然可以降低EGFR的表达,但是差异无统计学意义,miR-4792 inhibitor可以升高EGFR的表达,但是差异无统计学意义,这表明miR-4792可以在转录水平对EGFR进行调控,但可能主要在翻译水平对EGFR进行调控。六、miR-4792及EGFR在隐球菌性脑膜炎患者治疗前后的表达水平变化我们收集了11位经过标准治疗方法且已经治愈的隐球菌性脑膜炎患者治疗前后的脑脊液,RT-q PCR提示治疗后患者脑脊液中miR-4792的表达水平较治疗前明显升高,而EGFR表达量较治疗前明显下降,这和我们的细胞实验相符。我们绘制了ROC曲线,分析提示miR-4792和EGFR的ROC曲线下面积均>70%,p<0.05,提示miR-4792和EGFR可以作为隐球菌性脑膜炎治疗效果的评判标准之一。综合以上研究,我们发现miR-4792在新生隐球菌感染BV2细胞后表达明显下降,而EGFR明显升高;且验证miR-4792和EGFR有结合位点,可以靶向降解EGFR;EGFR抑制剂（AG1478）可以显著下调EGFR的表达,上调miR-4792的表达,且抑制小胶质细胞活化;EGFR抑制剂及miR-4792 mimics都可以对MAPK通路及相关炎症因子进行调控;且隐球菌性脑膜炎患者治疗前后脑脊液中miR-4792与EGFR的表达变化与前期细胞实验结果相符,表明miR-4792及EGFR可以作为隐球菌性脑膜炎的潜在的治疗靶点及治疗效果的评判标准之一。