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本文通过对肉鸡主动免疫Ob-R的胞外域不同片段,探讨免疫Ob-R片段对鸡脂肪生长的影响,及探讨免疫Ob-R片段调控鸡脂肪生长的可行性。
根据鸡Ob-R基因编码区cDNA序列(GenBank登录号:AB033383)设计引物,分别以鸡大脑和F3卵泡颗粒层组织总RNA为模板,利用RT-PCR获得了Ob-R的三个cDNA片段,分别位于编码区的第106~926、1006~1412和1362~2840位核苷酸。将Ob-R第101-300AA和581-830AA位两个片段分别克隆到表达载体pRSET A的BamHⅠ和HindⅢ两酶切位点之间,分别被命名为pObR-Q和pObR-H。
pObR-Q重组质粒在大肠杆菌Ecoli.BL21(DE3)中多以包涵体的形式表达出相对分子量为26.8kD的融合蛋白,包括质粒编码的N端36个残基,以及Ob-R101-300AA片段的200个氨基酸残基。IPTG浓度为0.1mM培养4h时,pObR-Q重组融合蛋白的表达量达到最高,占总菌体蛋白量的44%左右。
pObR-H重组质粒在大肠杆菌Ecoli.BL21(DE3)中表达的融合蛋白,经可溶性分析多以包涵体的形式存在,理论相对分子量为32.5kD,包括pRSETA质粒本身的36个氨基酸残基,以及目的片段250个氨基酸残基。pObR-H的最佳IPTG诱导条件为0.5mM培养5h时,最高表达量为19.1%。用乳糖替代IPTG也成功表达出了pObR-H的重组蛋白,乳糖最佳诱导浓度为2.92mM,诱导6h时蛋白表达量最高,占总菌体蛋白的16.2%。乳糖最佳诱导时机为OD600值为1.3时,占菌体蛋白的20%。pObR-Q和pObR-H的重组融合蛋白可经50%Ni-NTA树脂纯化,用针对来自表达质粒pRSETA上氨基酸片段的抗体进行的免疫印迹检验都产生了特异性目的条带。
将大量表达的pObR-Q和pObR-H重组融合蛋白经50%Ni-NTA树脂纯化后经非恒速下降的尿素浓度和非恒速上升的pH值梯度进行透析除盐,制成油乳剂疫苗。对50日龄的黄羽肉鸡进行首次免疫,在为期60天的试验中,隔28天加强免疫一次。主动免疫pObR-H融合蛋白组,在鸡体内产生了较高水平的抗体。其腹脂重和腹脂率显著低于对照组(P<0.05),腹脂重降低了40.4%,腹脂率降低了44.2%,采食量和体增重等生长性能指标上明显好于对照组。免疫pObR-Q融合蛋白组跟对照组相比,采食量、体增重和腹脂量都较低,但差异不显著(P>0.05),其中,腹脂率降低了35.4%。这些结果表明免疫Ob-R片段影响了鸡的脂肪生长。
下丘脑中调节食欲的NPY和POMC mRNA表达水平各组间没有显著差异(P>0.05)。肝脏和肌肉组织中UCP3 mRNA表达水平对照组极显著(P<0.01)或显著低于后段处理组(P<0.05),也略低于前段处理组,但差异不显著;脂肪组织中PPAR-γmRNA表达水平对照组高于处理组,但差异不显著(P>0.05);肌肉组织中Ob-R mRNA表达水平对照组低于处理组但差异都不显著(P>0.05)。以上结果表明主动免疫Ob-R片段通过增加肝脏、肌肉中的脂肪代谢和减少脂肪组织中脂肪合成量,从而影响了鸡脂肪的生长沉积。
以上脂肪生长和Leptin效应基因表达的数据提示,免疫Ob-R片段产生的抗体有可能模拟了Leptin的作用,从而促进脂肪代谢并降低了脂肪生长,今后有必要进一步通过细胞信号传导方法证实这一点。