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第一部分脑出血后Miro1蛋白在大鼠脑组织中表达水平的变化目的研究在成年雄性大鼠脑出血(ICH,Intracerebral hemorrhage)后继发性脑损伤(SBI,secondary brain injury)中Miro1(Mitochondrial Rho GTPase1)蛋白表达水平的变化。方法1、建立体内ICH模型:微量注射器抽取大鼠自体心脏血缓慢注入右侧大鼠脑部基底节区。2、实验分组:6只大鼠被随机选入Sham组作对照组,建模后存活的42只大鼠被随机分入ICH后3h,6h,12h,24h,48h,72h和7d组,每组分6只,在对应的时间点进行安乐死处理并留取脑组织。3、利用蛋白质免疫印迹实验(Western blot,WB)和免疫荧光(Immunofluorescence,IF)评估每组血肿周围脑组织标本中Miro1蛋白在ICH后不同时间点的表达变化。结果1、Western blot:与Sham组相比,大鼠ICH后24h血肿周围脑组织中Miro1表达量开始显著增高,并在ICH后48h达到峰值(P<0.01)。2、免疫荧光:大鼠ICH后48h脑组织神经细胞中Miro1水平明显高于Sham组。结论大鼠ICH对脑组织神经元内参与线粒体运输移动和分布的Miro1蛋白有影响,且血肿周围脑组织内Miro1蛋白表达增高。第二部分基因调控Miro1蛋白表达对大鼠ICH后SBI的影响目的运用相关基因试剂(人重组Miro1过表达蛋白、Miro1小干扰RNA)通过干预和调控颅内Miro1蛋白表达水平来研究其对大鼠ICH后SBI的影响。方法实验分组:18只大鼠被随机选取分配入Sham组作为对照组处理,随机选取90只大鼠均分到ICH组、ICH+Vehicle(过表达对照)组、ICH+rh Miro1(人重组Miro1过表达蛋白)组、ICH+Si-NC(干扰对照)组、ICH+Si-Miro1(小干扰RNA)组,每组18只并对其进行相应的操作处理,如处理环节中死亡,则随机选取新的大鼠补充进组。在上述各组18只大鼠中,每组均随机选取6只进行安乐死处理,留取脑组织标本进行Western blot、FJB染色、TUNEL染色。在上述各组剩余的12只大鼠中,每组再随机选择6只进行安乐死处理并留取脑组织进行脑水肿实验。上述各组中最后剩余的6只大鼠进行神经功能学评分、水迷宫实验和转轮实验。结果Western blot:在各组ICH后48h血肿周围脑组织内,ICH组Miro1蛋白水平比Sham组明显增高(P<0.01);ICH+rh Miro1组Miro1蛋白水平明显高于相应对照组(P<0.05);然而Miro1蛋白表达水平在ICH+Si-Miro1组则显著低于相应对照组(P<0.05);ICH组与两个相应对照组中的Miro1表达量无明显差异。脑组织切片FJB染色和TUNEL染色:ICH+rh Miro1组大鼠在ICH后神经元的调亡和坏死阳性率显著降低(P<0.05);ICH+Si-Miro1组大鼠在ICH后神经元的调亡和坏死阳性率则升高(P<0.05)。脑水肿实验:大鼠ICH后出现脑水肿,ICH+rh Miro1组脑水肿程度存在一定程度的减轻;ICH+Si-Miro1组脑水肿则存在一定程度的加重。行为学:大鼠ICH后出现神经行为学损伤;ICH+rh Miro1组神经行为学损伤显著减轻;ICH+Si-Miro1组神经行为学损伤存在加重。结论过表达的Miro1可减轻大鼠ICH后SBI的神经元凋亡和坏死、脑水肿以及改善ICH引起的一系列神经行为学损伤。第三部分Miro1蛋白在大鼠ICH后SBI的潜在机制探索目的利用Oxy Hb(氧合血红蛋白)在体外模拟体内ICH模型,进一步探索Miro1蛋白对神经元的影响及潜在作用机制。方法行原代神经元培养,分成对照组和Oxy Hb刺激后6h、12h、24h、48h、72h组。运用Western blot评估神经元内Miro1的水平。提取原代神经元进行培养,分成对照组、Oxy Hb刺激组、Oxy Hb+Vector(过表达对照)组、Oxy Hb+OE-Miro1(过表达Miro1)组、Oxy Hb+Si-NC(干扰对照)组、Oxy Hb+Si-Miro1(小干扰RNA)组。分别进行Western blot、细胞免疫荧光染色、线粒体膜电位检测(JC-1)、活死细胞染色和流式细胞仪分析。结果Western blot:在Oxy Hb处理神经元24h后,Miro1蛋白表达水平显著增高并达到最高值(P<0.05)。细胞免疫荧光染色定位:Miro1分布于神经元的胞体和轴突中,线粒体驱动蛋白Kinesin(Kif5A+5B+5C)集中分布在神经元胞体和轴突远端,线粒体动力蛋白Dynein明显分布于神经元的胞体和轴突近端。流式细胞仪分析:与对照组比,Oxy Hb组增加早期凋亡细胞百分比同时减少活细胞比例;Oxy Hb+OE-Miro1组能显著减少细胞早期凋亡和坏死并提高活细胞比例;Oxy Hb+Si-NC组细胞早期凋亡和坏死比例升高同时活细胞比例明显降低。活死细胞染色:过表达Miro1能显著提高活细胞百分比。线粒体膜电位检测(JC-1):过表达Miro1能提高线粒体膜电位水平,减轻神经元的损害。结论ICH后神经元内Miro1蛋白协助线粒体分布运输,过表达的Miro1在Dynein蛋白的协助下逆向转运损伤的线粒体到胞体内进行修复,同时在Kinesin蛋白的帮助下进行正向转运修复后的线粒体到轴突再分布,从而提高线粒体活性以及神经元活性。