慢性脑积水是蛛网膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage, SAH)后的常见并发症,但具体机制不清,动物实验及临床检查显示出血后脑积水与转化生长因子β1 (Transforming growth factor-beta 1, TGF-β1)过度表达导致的柔脑膜纤维化、蛛网膜下腔细胞外基质(extracellular matrixc, ECM)沉积有关。柔脑膜是蛛网膜和软脑膜的合称,二者在胚胎发育和组织分化上关系密切且均起源于神经管周围的间充质。蛛网膜下腔为蛛网膜与软脑膜之间的空隙,其间有大量纤维小梁贯穿。胶原纤维为柔脑膜中最主要的成分,柔脑膜细胞间形成大量桥粒和紧密连接,构成防止脑脊液通透的屏障。由于离体条件下柔脑膜来源的细胞在形态学及细胞表面蛋白表达方面的差异性,且柔脑膜细胞具有一定的干细胞特性,因此目前认为柔脑膜细胞是脑内特殊的成纤维细胞。合成胶原的主要细胞可能是柔脑膜细胞,SAH后蛛网膜下腔内柔脑膜细胞大量增生是纤维化的重要因素,胶原的主要来源可能与脑脊液中炎症因子的刺激密切相关。细胞外基质(extracellular matrix ECM)的主要成分为胶原蛋白,包括工型、Ⅲ型、Ⅳ型和V型胶原等,ECM的合成与降解失衡是组织器官纤维化的基础。Ⅰ型前胶原合成Ⅰ型胶原时由蛋白酶水解下来的羧基端肽称为Ⅰ型胶原羧基端肽(procollagen Ⅰ C-Terminal propeptide P Ⅰ CP),Ⅲ型前胶原分泌到细胞外后被蛋白酶切下的N端肽称为Ⅲ型胶原氨基端肽(PIIINP),它们可作为胶原合成以及纤维化的间接指标。目前认为,蛛网膜下腔出血后胶原合成包括Ⅰ型和Ⅲ型,以Ⅰ型胶原产生为主,柔脑膜细胞中的Ⅰ型胶原蛋白、脑脊液中的PICP可作为反应柔脑膜及蛛网膜下腔纤维化的指标。Masson染色可以显示柔脑膜胶原纤维的厚度,可以作为柔脑膜纤维化的检测方法。目前认为SAH后细胞外基质沉积、柔脑膜纤维化与TGF-β1高表达有关,TGF-β 1信号传导主要由Smad蛋白家族完成。TGF-β1与相应配体结合形成受体复合物,激活Smads进入核,共同激活或抑制它们调节的靶基因的转录。Smads中Smad2,3传导TGF-β1的信号,目前TGF-(β1/Smad3信号系统已在肝脏、肾脏及心脏纤维化研究中得到证实。小分子RNA(microRNA, miRNA)是一类广泛存在于动植物基因组中的功能性非编码小分子RNA,在生长发育、细胞分化、增殖、凋亡、肿瘤发生等过程中发挥重要作用。近几年来,越来越多的报道证实miRNA表达失调与多种疾病,如癌症、心血管疾病、纤维化疾病,病毒感染等密切相关。microRNA-29(miR-29)是新近发现的一个与纤维化疾病紧密相关的小分子RNA家族,包括miR-29a、miR-29b、miR-29c三个亚型,在多种器官纤维化的调控中发挥着重要的作用,包括心脏、肝脏、肺组织纤维化、系统性硬化等。在心肌纤维化中,有研究显示miR-29参与TGFβ1/Smad3信号传导,且过表达miR-29可抑制心肌纤维化进展,但目前尚缺乏miR-29在蛛网膜下腔出血后脑膜纤维化、脑积水形成中的作用及其与TGFβ 1/Smad3相互关系的研究。我们用聚合酶链反应(real-time polymerase Chain Reaction, PCR)检测蛛网膜下腔出血模型大鼠脑膜组织内miR-29家族成员表达变化,miR-29a和miR-29b在脑膜中表达升高或表达不规律,而miR-29c表达明显下降,与miR-29在肝、肾、心脏纤维化研究中的结果相符,因此,我们在本研究中选用miR-29c作为研究对象。为此我们建立蛛网膜下腔出血大鼠模型,并通过miR-29c慢病毒载体过表达miR-29c,对比检测脑脊液中PICP的改变及Masson染色对比柔脑膜胶原纤维的厚度变化,并通过大鼠头部MRI检测其对脑积水的形成的影响,探讨miR-29c对蛛网膜下腔出血后脑积水形成的影响。另外,我们体外培养大鼠脑膜细胞,培养液中加用外源性TGF-p 1,对比抑制Smad3表达前后miR-29c表达变化及柔脑膜纤维化指标的改变,讨论miR-29c与TGF-β 1/Smad3信号系统在脑膜纤维化中的关系。首先通过建立大鼠蛛网膜下腔出血模型,检测出血后不同时间柔脑膜细胞中miR-29a/b/c表达变化,确定miR-29c在出血后表达下降,选择miR-29c为研究目标。然后新建大鼠SAH模型,检测大鼠SAH后TGF-β1表达升高,miR-29c表达降低,通过慢性毒载体LV-rno-miRNA-29c成功过表达miR-29c。对比检测脑脊液中PICP含量,表明蛛网膜下腔出血后脑脊液中PICP含量随柔脑膜纤维化升高,维持miR-29c过表达可下调蛛网膜下腔出血后脑脊液中PICP含量。通过柔脑膜Masson染色,说明维持miR-29c过表达后柔脑膜内胶原合成显著降低,大鼠头部MRI检测显示,对比大鼠过表达miR-29c可以降低大鼠脑积水形成的比率几率,减少脑积水的形成。体外培养大鼠柔脑膜细胞,培养液中加用外源性TGF-β1,通过小干扰RNA技术(short interfering RNA, siRNA),选择脂质体Lipofectamine(?) 2000作为载体,并且通过转染后Smad3抑制表达的对比,筛选samd3-rat-493作为转染目标。成功抑制Smad3表达后,检测到miR-29c表达升高,柔脑膜细胞中Ⅰ型胶原蛋白含量降低。综上所述,miR-29c高表达可以抑制柔脑膜纤维化,减少实验性蛛网膜下腔出血后脑积水的形成,并且可以通过TGF-β1/Smad3信号系统参与柔脑膜纤维化,抑制Smad3的表达上调miR-29c并抑制柔脑膜细胞纤维化。miR-29c将是治疗或预防蛛网膜下腔出血后脑积水可能的靶目标。第一部分miRNA-29c在实验性蛛网膜下腔出血后脑积水形成中的作用研究目的：研究miRNA-29c在实验性蛛网膜下腔出血后脑积水形成中的作用。方法：建立大鼠蛛网膜下腔出血模型,检测miRNA-29a/b/c在不同时间点的变化,选择miRNA-29c作为我们研究对象。建立大鼠蛛网膜下腔出血模型,并通过建立miR-29c慢病毒过表达载体过表达miR-29c,检测脑脊液中PICP含量变化及柔脑膜厚度改变,以及其对脑积水形成的影响。1.选择研究目标：通过立体定向仪,建立10只大鼠蛛网膜下腔出血模型,10只空白对照组大鼠。分别于建模前、建模后3天、7天、10天、14天,检测脑膜miRNA-29a、b、c变化。确定选择miRNA-29c作为研究对象。2. miRNA-29c在蛛网膜下腔出血中的作用：2.1选取48只大白鼠,随机数字表法分为假手术组(16只)、空白慢病毒组(16只)和实验组(16只,LV-rno-miRNA-29c组)。全部3组行大鼠头部MRI。建立miR-29c慢病毒过表达载体LV-rno-miRNA-29c,并通过立体定向仪将入5μL生理盐水、空白慢病毒、实验组(LV-rno-miRNA-29c组)分别植入假手术组、空白病毒对照组、实验组大鼠。1周后实验组、空白病毒组采用枕大池二次注血法建立蛛网膜下腔出血模型,假手术组枕大池注入等量生理盐水。2.2.3周后假手术组、空白病毒对照组和实验组行头部MRI检查,对比各组大鼠脑室系统变化。2.3.3周后通过PCR检测脑脊液TGF-p 1、miR-29c含量。ELLISA方法检测脑脊液实PICP含量变化,Masson染色检实验组大鼠柔脑膜厚度。结果：1.选择研究目标：SAH后3、7、10、14天大鼠脑膜miR-29a含量升高,miR-29b含量不稳定,miR-29c含量降低。我们选择miR-29c作为研究目标。2. miR-29c在SAH后脑积水中的作用2.1.假手术组、空白病毒对照组和实验组分别检测ELLISA方法检测脑脊液PICP,显示实验组(过表达miR-29c)表达增加。2.2. Realtime PCR检测各组柔脑膜细胞TGF-p 1、miR-29c的表达,实验组(过表达miR-29c)柔脑膜细胞中miR-29c含量增加,且实验组及空白病毒对照组TGF-β1含量较假手术组增加。2.3.磁共振检查显示显示实验组(过表达miR-29c)较空白病毒组脑室扩大的比例减少,假手术组未出现。结论：蛛网膜下腔出血可以导致miR-29c下降,且过表达miR-29c可以抑制柔脑膜纤维化,并减少慢性脑积水的形成。第二部分miR29c-TGFβ1/Smad3在柔脑膜纤维化的作用研究目的：研究miR-29c与TGFβ 1/Smad3信号系统在柔脑膜纤维化中的作用。方法：体外培养大鼠原代柔脑膜细胞,培养液中加用TGF-p 1,并通过小干扰RNA技术,利用脂质体2000(Lipo2000)转染smad3-siRNA,抑制Smad3表达,对比检测miR-29c.柔脑膜纤维蛋白原Ⅰ型的改变。建立三个实验组：实验组(5ng/ml TGF-β1+smad3-siRNA组)、内对照组(5ng/ml TGF-β1+control-siRNA组)、空白对照组(Ong/ml TGF-β1 +control-siRNA组),各组siRNA预处理24小时后,给予TGF-β1刺激48小时。行RT-PCR检测miR-29c, WESTERN检测smad3、Ⅰ型胶原蛋白。1.购买大鼠原代柔脑膜细胞,通过细胞冻存及复苏体外培养原代大鼠柔脑膜细胞。应用小干扰RNA技术,建立脂质体2000 (Lipo2000)转染smad3-siRNA,加入培养液中抑制,siRNA预处理24小时后,给予TGF-β1刺激48小时。2.行RT-PCR检测miR-29c,WESTERN检测smad3、Ⅰ型胶原蛋白。结果：1.成功建立smad3-siRNA并转染脑膜细胞,WESTERN检测smad3较其他两组下降,证实实验组siRAN-Smad3可以抑制smad3表达。2.抑制smad3表达后,RT-PCR检测脑膜细胞中对照组miR-29c表达升高,WESTERN检测脑膜细胞中Ⅰ型胶原蛋白含量降低。结论：miR-29c参与TGFβ1/Smad3信号系统在柔脑膜纤维化中的传导,并且抑制Smad3的表达,可以使miR-29c表达升高,使柔脑膜纤维化减轻。