【摘 要】
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背景冷休克蛋白RBM3是一种RNA结合蛋白,受亚低温刺激而高水平表达。RBM3广泛参与细胞保护、蛋白质翻译、microRNA的表达调控等细胞进程。帕金森病(PD)是一种主要由大脑黑质多
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背景冷休克蛋白RBM3是一种RNA结合蛋白,受亚低温刺激而高水平表达。RBM3广泛参与细胞保护、蛋白质翻译、microRNA的表达调控等细胞进程。帕金森病(PD)是一种主要由大脑黑质多巴胺能神经元变性失活而引发的疾病,是仅次于阿尔茨海默病的世界上第二大神经退行性疾病。MPP~+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡是国际上普遍接受的PD细胞模型。研究发现,亚低温对阿尔茨海默病具有显著的保护作用,且可能由RBM3介导。然而,亚低温在PD细胞模型中是否具有保护作用,以及RBM3在其中的具体作用及机制尚不清楚。目的1.探究基于MPP~+诱导的PD细胞模型中RBM3的表达情况;2.分析亚低温对基于MPP~+诱导的PD细胞模型的保护效果;3.研究RBM3对基于MPP~+诱导的PD细胞模型的保护作用;4.预测RBM3的潜在功能域,并初步分析其对RBM3细胞功能的影响方法1.检测MPP~+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡过程中RBM3的表达情况以SH-SY5Y细胞和HEK293FT细胞作为研究对象,用MTT法和Western blotting评价不同浓度的MPP~+的细胞毒性;用q-PCR和Western blotting检测MPP~+对RBM3表达的影响。2.检测亚低温(32 ~oC)对MPP~+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的影响作用将细胞置于37/32 ~oC恒温细胞培养箱中24 h后,分别加入不同浓度的MPP~+诱导细胞凋亡。用Western blotting、MTT法、TUNEL染色法和caspase3/7荧光素酶检测方法分别检测cl.PARP、细胞活力、DNA片段化和caspase3/7酶活性。检测结果与对照组(37 ~oC细胞组)进行比较。3.检测RBM3对MPP~+诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的影响作用以pIRES2-EGFP为载体,构建RBM3真核过表达质粒,并转染进SH-SY5Y细胞中,分别加入不同浓度的MPP~+诱导细胞凋亡。用Western blotting、MTT法、TUNEL染色法和caspase3/7荧光素酶检测方法分别检测cl.PARP、细胞活力、DNA片段化和caspase3/7酶活性。检测结果与对照组(转染空载细胞组)进行比较。4.初步验证RBM3的潜在功能域用DNAMAN软件分析RBM3的RGG结构域,用KinasePhos软件预测RBM3的潜在磷酸化位点。以pXJ40-myc为载体,构建潜在结构域定点突变型RBM3真核过表达质粒,并瞬时转染SH-SY5Y细胞,对核-质蛋白进行分离与提取。Western blotting检测RBM3核质分布情况,检测结果与对照组(转染空载质粒细胞组和转染野生型RBM3重组质粒细胞组)进行比较。结果1.MPP~+引起细胞凋亡的过程中,RBM3表达水平急剧降低;MPP~+预处理抑制亚低温对RBM3的诱导;2.32~oC预处理24 h后,MPP~+诱导产生的细胞凋亡反而更多;3.外源性过表达RBM3显著降低MPP~+诱发的细胞凋亡;4.成功构建了5个RBM3点突变体;RBM3突变体(RR90/105AA)主要定位于细胞核中;RBM3突变体(S102A和/或Y129A)主要定位于细胞核中。结论1.MPP~+既能下调人神经母瘤细胞SH-SY5Y细胞本体RBM3的表达水平,也能干扰亚低温对RBM3的诱导表达;2.亚低温很可能对MPP~+诱导的细胞凋亡没有保护作用,但冷休克蛋白RBM3能保护人神经母瘤细胞SH-SY5Y细胞免受MPP~+诱导的细胞毒性;3.RBM3的核质分布不受其RGG结构域和预测潜在位点磷酸化修饰的影响。4.相对于亚低温,RBM3很可能具有更广泛的神经保护效应,为RBM3特异性过表达策略应用于临床治疗帕金森病提供了有价值的参考。
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