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褪黑素（MLT）可作为一种信号分子参与肠道微生物,通过释放细胞调节因子影响微生物区系结构以及其代谢产物,肠道微生物能够识别MLT结合位点并响应来自肠道的MLT信号。但目前MLT在肠道内进行信号转导的通路尚未明确。因此,本研究旨在通过体外模拟瘤胃发酵技术探究MLT与瘤胃菌群及其代谢产物之间的关系,阐述MLT调控瘤胃微生物的具体代谢机制。试验一、体外法研究褪黑素对瘤胃发酵和菌群结构的影响本部分试验旨在研通过体外模拟瘤胃发酵技术研究MLT对瘤胃发酵参数和菌群结构的影响。试验共分为3组,分别为人工唾液+标准MLT溶液（CK0组）、人工唾液+瘤胃液（CK1组）以及人工唾液+瘤胃液+标准MLT溶液（MLT组）,体外模拟培养24 h,采集发酵液测定MLT浓度以及CK1和MLT组中的瘤胃发酵参数和瘤胃菌群结构。结果表明,CKO组中MLT浓度要显著高于CK1且显著低于MLT组,CKO组中MLT降解速率要显著低于CK1和MLT组（P＜0.05）;发酵参数中pH、氨氮浓度以及微生物蛋白无显著变化,但MLT组中丙酸、异丁酸、丁酸、戊酸、TVFA浓度显著增加,乙丙比显著降低（P＜0.05）,瘤胃发酵类型改变;MLT组α多样性增加,MLT组Shannon指数和Simpson指数显著高于CK1组（P＜0.05）;在门水平上,拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门均为两组优势菌,其中,MLT组拟杆菌门、疣菌纲显著高于对照组,变形菌门、古细菌显著低于CK1组（P＜0.05）;在属水平上,MLT组的不动杆菌属、普雷沃氏菌科UCG-004、甲烷杆菌属相对含量显著低于CK1组（P＜0.05）,毛螺菌科NK4A136 group、理研菌属、韦荣氏球菌科UCG-001、新月形单胞菌属、琥珀酸弧菌属、嗜粘蛋白-艾克曼菌和瘤胃杆菌属相对含量显著高于CK1组（P＜0.05）。本部分试验结果表明,MLT对瘤胃微生物VFA浓度有显著影响,提高丙酸、异丁酸、丁酸、戊酸、TVFA浓度。MLT能够显著降低发酵液有害菌不动杆菌相对丰度,说明MLT对于不动杆菌有显著的抑制作用;增加有益菌毛螺菌科NK4A136 group、理研菌属、韦荣氏球菌科UCG-001、新月形单胞菌属、琥珀酸弧菌属、嗜粘蛋白-艾克曼菌和瘤胃杆菌相对丰度。试验二、基于LC-MS研究褪黑素对瘤胃细菌代谢的影响本部分试验通过代谢组学技术探究MLT对瘤胃微生物代谢产物的影响,进一步探讨MLT对瘤胃微生物代谢具体调控机制,进一步挖掘代谢差异物和富集代谢通路。试验分组同试验一。差异代谢物结果表明,MLT组亚精胺、苯乙酮、吲哚-3-甲基、谷胱甘肽、色氨酸羟化酶、黄嘌呤酸、吲哚、苯丙酮酸等代谢物含量显著高于CK1组（P＜0.05）;Pathway Analysis功能分析结果显示,差异代谢物主要涉及的信号通路有:谷胱甘肽代谢、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成（P＜0.05）,进一步把差异代谢物归类代谢通路,发现谷胱甘肽、亚精胺属于谷胱甘肽代谢通路中的代谢物质;吲哚、色氨酸羟化酶属于苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸生物合成代谢通路中代谢物;色氨酸羟化酶、黄嘌呤酸、吲哚-3-甲基是色氨酸代谢通路中的代谢物;皮尔曼（Spearman）分析和Network分析结果显示,差异微生物和差异代谢物具有很强的相关性,新月形单胞菌、琥珀酸弧菌、韦荣氏球菌科UCG-001、理研菌与谷胱甘肽代谢通路代谢物显著相关,新月形单胞菌、琥珀酸弧菌、韦荣氏球菌科UCG-001和理研菌与苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成通路代谢物显著相关,新月形单胞菌、琥珀酸弧菌、韦荣氏球菌科UCG-001、理研菌、毛螺菌科NK4A136 group、瘤胃杆菌与色氨酸代谢通路代谢物显著相关（P＜0.05）。本部分试验结果表明,MLT可能通过调控瘤胃微生物进而调控谷胱甘肽代谢,苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成及色氨酸代谢通路。试验三、褪黑素作用瘤胃微生物受体机制与调控通路分析本部分试验通过对显著差异代谢通路上关键酶活性检测以及代谢产物含量的测定,然后对差异微生物、差异代谢物和关键酶相关性分析,进一步验证MLT调控此3条差异代谢通路的具体机制。试验分组同试验一。试验测定了 MLT组和CK1组吲哚胺2,3-双加氧酶等9种关键酶和15种代谢物含量。结果表明,谷胱甘肽代谢通路中,MLT组谷胱甘肽-S-转移酶（GST）、亚精胺合成酶（SPDS）酶活性显著高于CK1组,增加代谢物谷胱甘肽、腐胺、亚精胺、N-乙酰鸟氨酸、半胱氨酸含量（P＜0.05）;苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成通路中,MLT组3-脱氧-D-阿拉伯糖型-庚酮糖酸-7-磷酸合成酶（DAHP）、邻氨基苯甲酸合成酶（AS）、色氨酸合成酶（TS）酶活性显著高于CK1组,增加代谢物邻氨基苯甲酸、苯丙酮酸含量（P＜0.05）;色氨酸代谢通路中,MLT组色氨酸羟化酶（TPH）、芳香胺-N-乙酰转移酶（AANAT）、乙酰复合胺-O-甲基转移酶（ASMT）、吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO）酶活性显著高于CK1组,增加代谢物血清素、犬尿氨酸、喹啉酸、吲哚乙酸、吲哚-3-甲基、吲哚、6-羟基褪黑素含量（P＜0.05）。本部分试验结果表明,MLT能够显著增强谷胱甘肽代谢通路关键酶GST、SPDS酶活性,显著增加谷胱甘肽、亚精胺;显著增强苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成通路DAHP、AS、TS酶活性,显著增加苯丙酮酸;显著增强色氨酸代谢通路中的TPH、AANAT、ASMT、IDO酶活性,显著增加吲哚、吲哚-3-甲基、6-羟基褪黑素（P＜0.05）。综上所述,体外研究表明,MLT对培养液瘤胃发酵、微生物及其代谢物有显著影响。主要表现为MLT改变瘤胃菌群结构,显著抑制不动杆菌相对丰度,增加毛螺菌科NK4A136 group、理研菌属、韦荣氏球菌科UCG-001、新月形单胞菌属、琥珀酸弧菌属、嗜粘蛋白-艾克曼菌和瘤胃杆菌相对丰度。MLT可能通过改变瘤胃菌群结构,进一步调控瘤胃微生物代谢,从而调控代谢通路。具体表现为毛螺菌科NK4A136 group、普雷沃氏菌科UCG-004、韦荣氏球菌科UCG-001、甲烷杆菌属、新月形单胞菌在GST、SPDS酶的作用下,调控精氨酸-谷胱甘肽通路,提高谷胱甘肽和亚精胺代谢物含量。普雷沃氏菌科UCG-004、甲烷杆菌、琥珀酸弧菌、新月形单胞菌在DAHP、AS、TS酶作用下,调控“芳香族氨基酸生物合成-色氨酸生成分支”该条通路,显著提高了苯丙酮酸含量以及色氨酸;随后色氨酸进行代谢,毛螺菌科NK4A136 group、普雷沃氏菌科UCG-004、韦荣氏球菌科UCG-001、甲烷杆菌、新月形单胞菌、琥珀酸弧菌和瘤胃杆菌在TPH、IDO酶作用下,调控“色氨酸-犬尿氨酸代谢”通路,显著提高了黄嘌呤酸、喹啉酸代谢物含量;毛螺菌科NK4A136 group、普雷沃氏菌科UCG-004、甲烷杆菌在AANAT、ASMT酶作用下,通过调控“色氨酸-色胺-血清素”通路,提高6-羟基褪黑素含量。